농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

인간 자원 봉사자의 샘플 사용은 스크립스 연구소 기관 검토 위원회가 승인 한 프로토콜을 따랐습니다. 헌혈 전에 기증자로부터 통보된 동의를 얻었다. 1. 시약 준비 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) Ficoll-Plaque Plus 격리를 통해 정상적인 인간 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 회복하십시오. 90% 태아 소 혈청(FBS) 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 5천만 개의 세포/mL에서 냉동 보존. 세포를 -80 °C에서 동결시키고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다. 분류를 위한 표적 항원 펩티드 에 라벨링 말단 비오틴을 사용하여 표적 단백질(최대 70잔고)에 특이적인 펩타이드를 생성하거나 수득한다. 별도의 튜브에 PE (R-phycoerythrin) 또는 APC (알로피코시아닌)에 공동으로 부착 된 스트렙타비딘과 각 개별 생체 면역 펩티드의 라벨 4 nmol. 9:1 펩티드 대 스트렙타비딘(SA)의 몰 비를 사용하여 SA-PE및 5.7 μM SA-APC의 최종 농도가 약 3.2 μM인 것을 사용하여 준비합니다. 비오틴 테트라머를 음의 대조군으로 준비하십시오. 각 펩티드 혼합물을 밤새, 어둠 속에서, 느린 혼합으로 4°C에서 배양한다. 폴리아크릴아미드 비드가 함유된 마이크로컬럼을 통해 표지된 펩티드를 통과하여 언바운드 형광포를 제거합니다. 펩티드 테트라머를 4°C에서 최대 2개월까지 보관하십시오. 2. 셀 정렬 CD22+ 격리 전에 적어도 1시간 에서 16시간, 공여체 PBMC를 해동하고 37°C에서 휴식을 취하도록 한다. 냉동고에서 냉동 PBMC의 바이알을 제거하고 즉시 37°C 수조로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다. 바이알이 거의 해동되면 작업 영역으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮 각 바이알의 내용물(기증자를 분리된 상태로 유지)을 함유하는 50 mL 튜브로 옮니다. 50 mL의 최종 볼륨에 매체를 추가합니다. 내용물부드럽게 섞습니다. 실온에서 6 분 동안 370 x g의 원심 분리기. 상급체를 버리고, RPMI 완전한 배지의 15 mL에서 세포를 재중단하고 세포 수를 수행한다. RPMI 완전한 배지를 사용하여 세포 농도를 2.0 x 107 세포/mL로 조정하고, 37°C에서 T75 플라스크 또는 더 큰 세포로 세포를 옮기고, 해동된 세포의 회복 시간을 허용하기 위해 적어도 1시간 및 최대 16시간 동안 37°C에서 배양한다. 4°C에서 6분 동안 370 x g에서 세포(원하는 경우 풀링)와 원심분리기를 수집한다. 상급을 버리고 5 mL의 얼음 차가운 MACS 버퍼 (PBS, pH 7.6 함유 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)에서 세포를 다시 중단하고 MACS 버퍼로 50 mL로 가져 와서 세포 수를 수행합니다. 4 °C에서 7 분 동안 400 x g에서 세포를 원심 분리합니다. CD22 마이크로비드에서 캡처를 통해 양성 선택으로 CD22+ B 세포를 분리합니다. 모든 세정에 MACS 버퍼를 사용합니다. 4 °C에서 7 분 동안 400 x g의 카운트 및 원심 분리기. 예상 회복은 전체 PBMC 인구의 5-10%입니다. mL FACS 버퍼당 4,000만 개의 세포를 재중단하고(트리스 버퍼, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 포함하는 pH 8.0)를 개별적으로 또는 풀로서 기증자의 세포 염색을 진행한다. 메모리 B 세포 분류를 위한 얼룩 세포 사용된 각 라벨링 형광에 대한 세포 측정기 설정 및 보상에 대한 세포의 aliquot를 제거합니다. 스테인드되지 않은 세포를 대조군으로 포함시다. 얻어진 CD22+ 셀 수에 대한 최종 염색 부피(100 μL당 2백만 염색)를 계산합니다. 제조업체의 희석 권장 사항에 따라 B 세포(CD19-PerCP-Cy5.5), IgG(IgG-FITC) 및 메모리 컴파트먼트(CD27-PECy7)에 대한 세포외 마커를 추가하고 부드럽게 혼합합니다. Aliquot 107 세포를 음성 대조를 위한 1.5 mL 튜브 내로 하고 나머지 세포를 15 mL 튜브로 옮김을 전달한다. 이중 표지된 비오틴-SA 테트라머를 PE 및 APC에 대해 각각 36 nM의 최종 농도로 음극 대조군 튜브에 추가하고, 분류 튜브내의 펩티드 수를 곱하고 FACS 버퍼(예: 10개의 펩티드 x 36 nM=360 nM)로 부피를 0.5 mL로 최종으로 가져온다. PE 및 APC에 대해 각각 36 nM의 분류 튜브에 펩티드 테트라머를 추가하고 TBS 버퍼로 100 μL 당 2×106으로 세포를 가져옵니다. 어둠 속에서 4 °C에서 배양하고 30-60 분 동안 부드럽게 회전합니다. 4 °C, 400 x g,7 분에서 2 x를 씻고 마지막 세척 전에 계산할 알리쿼트를 제거하십시오. 5 mL 필터 캡 튜브를 사용하여 셀을 필터링합니다. DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)를 세포막 무결성의 마커로 분류하기 직전에 0.3 μM 최종 농도에 추가합니다. 유세포 측정을 통한 단일 세포 분류 선별을 위해 96웰 PCR 플레이트 48개의 웰을 준비합니다. 마스터 믹스를 준비합니다: 샘플당 (10x RT 완충제 2 μL, RNase 억제제 0.5 μL, 멸균 PCR 등급의 물 7.5 μL). Aliquot 10 μL 당 잘, 뚜껑을 덮고, 분류준비가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오. 셀 선별기에서 음수 컨트롤을 실행하여 전체 샘플을 분석합니다. 단일 세포 분류에 적합한 세포 모집단을 격리하도록 유량 세포 분석 게이트를 설정합니다. FSC 영역 대 SSC 영역을 플롯하고 게이트 R1을 설정하여 림프구를 분리합니다. FSC 높이 대 FSC 너비를 플롯하고 게이트 R3를 설정하여 FSC 더블릿을 제외합니다. SSC 높이와 SSC 너비를 플롯하고 게이트 R4를 설정하여 SSC 더블을 제외합니다. SSC 높이 대 DAPI를 플롯하고 게이트 R5를 라이브 셀(DAPI-)을 격리하도록 설정합니다. IgG 대 CD19를 플롯하고 게이트 R6을 설정하여 IgG+ B 셀(CD19+ IgG+)을 분리합니다. IgG 대 CD27을 플롯하고 게이트 R7을 설정하여메모리 B 셀(CD27 높음)을 선택합니다. 플롯 항원-PE (Ag-PE) 대 항원-APC (Ag-APC) 및 이중 양성 게이트에서 적은 수의 이벤트와 함께 게이트 R8을 Ag-PE+/Ag-APC+ 사분면으로 설정합니다. 노이즈에 대한 신호 의 측정을 위해항원 양성(Ag+) 샘플로부터 동일한 수의 메모리 세포를 수집합니다. 표현형 CD19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC +(게이트 R8)를 갖는 단일 세포를 제조된 96웰 PCR 플레이트내로 정렬한다. 알루미늄 테이프 패드로 플레이트를 덮고, 400 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 만들고 향후 복제를 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 3. 단세포 복제 역전사 반응 80°C에서 단일 B 세포 정렬 플레이트를 제거합니다. 얼음을 2분 간 녹여서 3,300 x g에서 2분 동안 접시를 회전하여 개구전에 우물 바닥에 있는 컨텐츠를 풀로 합니다. 역이니머로서 10% 비이온성 세제와 올리고(dT)로 dNTP/버퍼 마스터 믹스를 준비합니다. 단일 세포를 포함하는 각 우물에 효소 믹스를 추가하고 혼합하지마십시오. 65 °C에서 5 분 배양하십시오. 100 mM DTT, RNase 억제제 및 역 전사 효소를 함유하는 효소 마스터 믹스를 추가하여 총 부피를 20 μL로 가져 와서 50 °C에서 10 분, 80 °C에서 10 분 동안 인큐베이터합니다. PCR 단계를 시작하기 전에 얼음으로 전송 다단계 중첩 PCR 반응 중첩된 PCR 반응은 중연쇄(HC) 및 경망(LC) 증폭에 사용된다. PCR 증폭의 첫 번째 라운드(Step I)의 경우, 정방향 프라이머 풀과 단일 역방향 프라이머를 사용하여 별도의 PCR반응에서 HC 및 LC 가변 영역을 증폭합니다(그림 2). 의도적으로, 전진 프라이머풀은 거라인 리더(L) 서열의 큰 비율을 증폭시키고 역프라이머는 경쇄(16)에 대한 카파(λ) 및 람다(λ)를 모두 포함하는각 사슬의 다운스트림 상수 영역에 특이적이다. 각 PCR(Step I) 반응에 대한 템플릿으로 cDNA 제품의 2.5 μL을 사용하십시오. 프라이머를 각각 1 μM의 최종 반응 농도에 추가합니다. 10x 폴리머라제 버퍼를 2배 농도로 두 배로 늘리고, 반응당 최종 부피를 25 μL로 가져옵니다. 50사이클 동안 [94°C/4분, 94°C/15s, 55°C/20초, 68°C/60s, 68°C/3분]을 사용하여 HC PCR 반응을 실행합니다. LC PCR 반응을 50사이클 동안 [98°C/4분, 98°C/15s, 72°C/20s, 72°C/60s, 72°C/3분]을 사용하여 실행합니다. 각 (단계 II) PCR 반응에 대한 템플릿으로 단계 I 제품의 2.5 μL을 사용합니다. HC 및 LC(λ 및 λ) 프레임워크 1 영역및 각 항체 사슬의 접합 영역에 특이적인 역방향 프라이머 풀에 특이적인 순방향 프라이머 풀을 추가합니다. 10x 폴리머라제 버퍼를 2배 농도로 두 배로 하고, 1단계와 동일한 파라미터를 사용하여 각각 50사이클씩 PCR 반응을 실행한다. 완료된 PCR 반응을 1% 아가로즈 젤에서 실행하여 양성 증폭 안타를 시각화합니다. 페어링된 앰플리온(동일한 세포에서 무겁고 가벼운 사슬 모두)을 회수하고 젤 추출을 통해 분리합니다. 정확한 결찰 혼합 계산을 위해 OD260을 통해 DNA 단편 농도를 결정합니다. 회수된 중쇄 및 경쇄 단편을 상용 키트를 사용하여 4-단편 결찰 반응을 사용하여 링커 프래그먼트 및 발현 벡터 백본과 결합한다. 상용 키트를 사용하여 결찰 반응을 화학적으로 유능한 박테리아로 변환합니다. 일단 항생제 플레이트에 도금되고, 나머지 형질전환 배양에 4 mL의 성장 배지(항생제)를 추가하고, 250 rpm에서 밤새 37°C를 배양한다. 이것이 “결찰 혼합 배양”입니다. 상용 키트를 사용하여 하룻밤 결찰 혼합 배양으로부터 miniprep DNA를 준비하고, 생성된 플라스미드 DNA 농도를 결정한다. 4. 항원 특이성 확인을 위한 ELISA 스크린 10 μg의 미니프렙 DNA를 양이온 지질 계 시약으로 10 mL의 현탁액 293 세포로 트랜스펙트하고, 125 rpm에서 회전하면서 37°C(8% CO2)에서 3-4일 동안 배양한다. 수확을 위해, 원심분리배양분1,000 x g에서 10분 및 정제된 배지를 회수한다. 단백질 A에 대한 친화성을 통해 초월제의 IgG 농도를 측정합니다. 각 IgG(상판)를 20 μg/mL에서 효소 연계 흡착제 분석법(ELISA)에 의해 분류에 사용되는 개별 펩티드에 대해 테스트하고, 스트렙타비딘 플레이트 또는 액틴에 포획하여 음성 대조군으로 포획하였다. 염소 항인간 과산화아제 이차 항체를 인간 IgG Fab에 대해 사용하여 재조합 클론을 검출한다. 배경을 빼면 OD > 0.5는 화면 양수로 정의됩니다. IgG 상판의 희석을 사용하여 mL당 20 μg에서 시작하여 농도 곡선을 생성하고, 초기 화면 ELISA에서 반응성을 나타내는 각 항원마다 OD에 대해 플로팅하여 추가 ELISA를 수행하여 화면 양성 안타를 확인합니다.