Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

O uso de amostras de voluntários humanos seguiu protocolos aprovados pela Diretoria de revisão institucional do Scripps Research Institute. O consentimento informado foi obtido dos doadores antes da doação de sangue. 1. preparação do reagente Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) Recupere pilhas mononucleares do sangue periférico dos doadores humanos normais pelo isolamento de Ficoll-Plaque Plus. Cryopreserve em 50 milhões Cells/ml em 90% soro bovino fetal (FBS) e 10% dimetil sulfóxido (DMSO). Congele as pilhas em-80 ° c e transfira ao nitrogênio líquido para o armazenamento a longo prazo. Rotulando peptídeos de antígeno alvo para classificação Gerar ou obter peptídeos específicos para a proteína alvo (até 70 resíduos de comprimento) com uma biotina terminal. Etiqueta 4 nmol de cada peptídeo biotinylated individual com estreptavidina covalentemente Unido ao PE (R-phycoerythrin) ou ao APC (allophycocyanin) em tubos separados. Prepare-se usando uma relação molar de 9:1 peptídeo para estreptavidina (SA), com uma concentração final de aproximadamente 3,2 μM para SA-PE e 5,7 μM SA-APC. Prepare os tetrâmeros da biotina como um controle negativo. Incubar cada mistura peptídica durante a noite, no escuro, a 4 ° c com mistura lenta. Remova o fluoróforo não acoplado passando peptídeos rotulados através de microcolunas contendo grânulos de poliacrilamida. Armazene os tetrâmeros do peptide até 2 meses em 4 ° c. 2. classificação de célula Pelo menos 1 h até 16 h antes do isolamento CD22 +, descongelar PBMCs doadores e permitir descansar a 37 ° c. Retire os frascos de PBMCs congelados do congelador e transfira imediatamente para um banho de água de 37 ° c. Quando os frascos estão quase descongelados, transfira para a área de trabalho. Transfira o conteúdo de cada frasco para injetáveis para um tubo de 50 mL contendo um meio pré-aquecido (mantendo os doadores separados). Adicionar meio a um volume final de 50 mL. Misture suavemente o conteúdo. Centrifugar a 370 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, resuma as células em 15 mL de meio completo de RPMI e realize uma contagem de células. Ajuste a concentração celular para 2,0 x 107 células/ml com meio RPMI completo, e transfira células para um balão T75 ou maior e incubar a 37 ° c por pelo menos 1 h e até 16 h para permitir o tempo de recuperação para as células descongelados. Recolher as células (pooling, se desejado) e centrifugar a 370 x g por 6 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e refaça as células em 5 mL de buffer de MACS com gelo frio (PBS, pH 7,6 contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA), leve para 50 mL com buffer de MACS e realize uma contagem de células. Centrifugue as células a 400 x g durante 7 min a 4 ° c. Isole as células CD22+ B por seleção positiva via captura em MICROESFERAS CD22. Use o buffer de MACS para todas as lavas. Contagem e centrifugação 400 x g por 7 min a 4 ° c. A recuperação esperada é de 5-10% da população total de PBMC. Reressuscitem as células em 40 milhões por mL de tampão FACS (tampão Tris, pH 8,0 contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA) e proceder com coloração celular dos doadores individualmente ou como uma piscina. Células de mancha para a triagem de célula B de memória Retire uma alíquota de células para o citometro configurado e compensação para cada um dos fluoróforos de rotulagem utilizados. Inclua células não manchadas como um controle. Calcule o volume de coloração final para o número de células CD22+ obtidas (coloração 2 milhões por 100 μL). Adicione marcadores extracelulares para células B (CD19-PerCP-Cy 5.5), IgG (IgG-FITC) e compartimento de memória (CD27-PECy7) de acordo com as recomendações de diluição dos fabricantes e misture suavemente. Aliquot 107 células num tubo de 1,5 ml para o controlo negativo e transfira as restantes células para um tubo de 15 ml. Adicione os tetrâmeros de biotina-SA rotulados duplos ao tubo de controle negativo em uma concentração final de 36 nm cada para PE e APC multiplicado pelo número de peptídeos no tubo de ordenação e trazer o volume para 0,5 ml final com tampão FACS (por exemplo, 10 peptídeos x 36 nm = 360 nm). Adicione os tetrâmeros do peptide ao tubo da sorte em 36 nanômetro cada para o PE e o APC e traga as pilhas a 2×106 por 100 μl com amortecedor de TBS. Incubar a 4 ° c no escuro e com rotação suave por 30-60 min. Lave 2x a 4 ° c, 400 x g, 7 min, removendo uma alíquota para contar antes da última lavagem. Filtre células usando tubos de tampão de filtro de 5 mL. Adicionar DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) mancha para 0,3 μM concentração final antes de classificar como um marcador de integridade da membrana celular. Triagem de célula única via citometria de fluxo Prepare 48 poços de placas do PCR 96-well para classificar. Prepare uma mistura mestra: (2 μL de tampão de 10x RT, 0,5 μL de inibidor de RNase, 7,5 μL de água estéril da PCR-classe) por a amostra. Aliquot 10 μL por poço, cubra e armazene a 4 ° c até estar pronto para a ordenação. Execute o controle negativo no classificador de célula, analisando o exemplo inteiro. Definir portões de citometria de fluxo para isolar as populações de células apropriadas para a triagem de célula única. Plotar área FSC vs área SSC e definir portão R1 para isolar linfócitos. Plotar a altura FSC versus a largura do FSC e configurar o Gate R3 para excluir os doublets do FSC. Plotar altura SSC vs largura SSC e definir portão R4 para excluir doublets SSC. Plotar a altura SSC vs DAPI e definir o portão R5 para isolar células ao vivo (DAPI-). Plotar IgG vs CD19 e definir o portão R6 para isolar as células IgG+ B (CD19+ IgG+). Plotar IgG vs CD27 e configurar o portão R7 para selecionar células B de memória (CD27alta). Plotar Antigen-PE (AG-PE) vs Antigen-APC (AG-APC) e definir portão R8 como um AG-PE+/AG-APC+ quadrante com um baixo número de eventos no portão duplo positivo. Colete um número igual de células de memória da amostra antígeno-positiva (AG+) para a determinação do sinal ao ruído. Classifique únicas pilhas que têm o phenotype CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (porta R8) em placas preparadas do PCR de 96-well. Cubra as placas com as almofadas de fita de alumínio, centrifugue por 1 minuto em 400 x g, e armazene-o em-80 ° c para a clonagem futura. 3. clonagem de célula única Reações de transcrição reversa Remova a placa de classificação de célula B única de 80 ° c. Descongelar no gelo por 2 min. Gire a placa por 2 min em 3.300 x g para o conteúdo da piscina na parte inferior dos poços antes de abrir. Prepare um Mix mestre dNTP/buffer com 10% de detergente não iônico e oligo (dT) como primer reverso. Adicione a mistura da enzima a cada poço que contem a única pilha e não misture. Incubar 5 min a 65 ° c. Adicione a mistura mestre da enzima contendo 100 mM DTT, inibidor de RNase, e enzima reversa da transcriptase para trazer o volume total a 20 μL. Incubar 10 min a 50 ° c, depois 10 min a 80 ° c. Transferência ao gelo antes de começar etapas do PCR Reações de PCR aninhadas em várias etapas As reações aninhadas separadas do PCR do uso são usadas para a corrente pesada (HC) e a amplificação da corrente clara (LC). Para a primeira rodada de amplificação de PCR (Step I), use um conjunto de primers para a frente e uma única cartilha reversa para amplificar as regiões variáveis HC e LC em reações de PCR separadas (Figura 2). Pelo projeto, o pool de primers para diante amplificará uma grande porcentagem de seqüências do líder do germline (L) e a primeira demão reversa é específica às regiões constantes a jusante de cada corrente, incluindo o Kappa (κ) e o lambda (λ) para correntes claras16. Use 2,5 μL do produto do cDNA como o molde para cada reação do PCR (etapa I). Adicionar primers à concentração de reacção final de 1 μM para cada um. Dobre o amortecedor da polimerase 10x à concentração 2x, traga o volume final a 25 μL por a reação. Executar reações de PCR HC usando [94 ° c/4 min; 94 ° c/15 s, 55 ° c/20 s, 68 ° c/60 s; 68 ° c/3 min] para 50 ciclos. Executar reações de PCR LC usando [98 ° c/4 min; 98 ° c/15 s, 72 ° c/20 s, 72 ° c/60 s; 72 ° c/3 min] para 50 ciclos. Use 2,5 μL do produto Step I como modelo para cada reação de PCR (passo II). Adicione o pool de primers Forward específicos para a região do quadro 1 de HC e LC (κ e λ) e um conjunto de primers reversos específicos para a região de junção de cada cadeia de anticorpos. Dobre o amortecedor da polimerase 10x à concentração 2x, e execute reações do PCR 50 ciclos cada um usando os mesmos parâmetros que etapa I. Execute as reações de PCR concluídas em gel de agarose a 1% para visualizar acertos positivos de amplificação. Recupere amplicões emparelhados (corrente pesada e clara da mesma pilha) e isole através da extração do gel. Determine a concentração do fragmento do ADN através do OD260 para cálculos exatos da mistura da ligadura. Combine fragmentos de cadeia pesada e leve recuperados com um fragmento de vinculador e a espinha dorsal do vetor de expressão usando uma reação de ligadura de 4 fragmentos usando um kit comercial. Transforme reações de ligadura em bactérias quimicamente competentes usando um kit comercial. Uma vez chapeado em placas antibióticas, adicionar 4 mL de meios de crescimento (com antibiótico) para a cultura de transformação remanescente, e incubar 37 ° c durante a noite em 250 rpm. Esta é a “cultura da mistura de ligadura”. Prepare o ADN do protocolo das culturas da mistura da ligadura da noite usando um jogo comercial, e determine a concentração resultante do ADN do plasmídeo. 4. tela ELISA para confirmação de antígeno-especificidade Transfect 10 μg de DNA protocolo com reagente à base de lipídios catiônico em 10 ml de células de suspensão 293, e incubar por 3-4 dias a 37 ° c (8% co2) enquanto gira a 125 RPM. Para a colheita, centrifugue a cultura 10 minutos em 1.000 x g e recupere meios esclarecidos. Meça a concentração de IgG nos sobrenadantes através da afinidade à proteína A. Teste cada IgG (em sobrenadante) a 20 μg/mL por ensaio de adsorvente enzimático (ELISA) contra os peptídeos individuais utilizados para a espécie, capturados em uma placa de estreptavidina ou actina como um controle negativo. Use um anticorpo secundário da peroxidase antihumana da cabra de encontro ao IgG humano Fab para detectar clones recombinantes. Após a subtração do fundo, o OD > 0,5 é definido como o positivo da tela. Confirme acertos positivos da tela realizando um ELISA adicional, usando diluições de sobrenadante de IgG para gerar uma curva de concentração a partir de 20 μg por mL, e plotando contra OD para cada antígeno mostrando reatividade na tela inicial ELISA.