Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen
Summary
Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.
Abstract
Das menschliche Antikörperrepertoire stellt eine weitgehend ungenutzte Quelle potenzieller therapeutischer Antikörper und nützlicher Biomarker dar. Während aktuelle Rechenmethoden, wie z. B. die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), enorme Datensätze über das Antikörperrepertoire auf Sequenzebene liefern, sind funktionale Daten erforderlich, um zu identifizieren, welche Sequenzen für ein bestimmtes Antigen oder einen Satz von Antigene. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Rückgewinnung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von einem menschlichen Blutspender. Diese Methode nutzt eine anfängliche Anreicherung von reifen B-Zellen und erfordert eine Kombination aus phänotychenZellmarkern und fluoreszierend markiertem Protein, um IgG-Speicher-B-Zellen über Durchflusszytometrie zu isolieren. Die bereiche der schweren und leichten Kettenvariablen werden dann geklont und erneut überprüft. Obwohl diese Methode auf das Speicher-B-Zellfach beschränkt ist, nutzt sie die Durchflusszytometrie, um Millionen von B-Zellen abzuhören, und gibt gepaarte schwere und leichte Kettensequenzen aus einer einzelnen Zelle in einem Ausdrucks- und Spezifitätsformat zurück. Antikörper, die mit dieser Methode zurückgewonnen werden, können für das therapeutische Potenzial in Betracht gezogen werden, können aber auch Spezifität und Funktion mit bioinformatischen Ansätzen verknüpfen, um das B-Zell-Repertoire innerhalb von Individuen zu bewerten.
Introduction
Antikörper sind eine wachsende Klasse von therapeutischen Molekülen, und das bestehende B-Zell-Repertoire in jedem Menschen ist eine potenzielle Quelle solcher Antikörper. Wenn sie von einem menschlichen Spender geborgen werden, erfordern sie keine Anpassung oder “Humanisierung”, Schritte, die für Antikörper erforderlich sind, die in anderen Tiersystemen erzeugt werden. Es gibt mehrere Methoden zur Identifizierung und Isolierung menschlicher Antikörper, einschließlich B-Zellaktivierung und -proliferation1, Verewigung über EBV-Transformation2,3und Erzeugung von Hybridom-Zelllinien4 ,5. Jedoch, alle diese Methoden erfordern umfangreiche Zellkultur zu überprüfen und Antigen-spezifische Antikörper zu überprüfen. Mit der Entwicklung der Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie, die die Identifizierung riesiger Mengen einzelner Sequenzen in Spenderproben ermöglicht, wurden die Informationen über das menschliche Antikörperrepertoire erheblich erweitert. Da NGS jedoch eine agnostische Sicht auf alle vorhandenen Sequenzen liefert, erlaubt es nicht die Identifizierung und Isolierung antigenspezifischer Antikörper, insbesondere bei seltenen oder niederfrequenten Antikörpern.
Der Zweck der “BSelex”-Methode ist es, antigenspezifische Antikörper aus zirkulierenden peripheren mononukleären Blutzellen bei menschlichen Spendern zu identifizieren und die Sequenzen dieser Antikörper zur weiteren Analyse zu isolieren und wiederherzustellen. Diese Methode nutzt Durchflusszytometrie und Zellsortierung, um den B-Zellrezeptor (BCR) zu nutzen, der auf der Oberfläche von Speicher-B-Zellen ausgedrückt wird. Millionen von B-Zellen können über die Durchflusszytometrie auf Antigenspezifität untersucht werden, bevor die molekularbiologischen Methoden mit niedrigerdurchsatzigem Satz initiiert werden. Eine gepaarte schwere und leichte Kettenidentifikation ist in den meisten NGS-Methoden, die Zellsequenzen in großen Mengen analysieren, nicht möglich. In der Methode, die wir hier beschreiben, werden Zellen einzeln isoliert, und eine gepaarte Wiederherstellung sowohl schwerer als auch leichter Kettensequenzen ist möglich, was das direkte Klonen und die Expression des vollständigen IgG ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzellklonen, und die Methoden, die wir hier beschreiben, basieren auf Methoden, die zuvor von Tiller und Kollegen entwickelt wurden11. Ihre Arbeit beschreibt die Rückgewinnung und das Klonen monoklonaler Antikörper, um das B-Zell-Repertoire beim Menschen auf der Ebene einzelner Zellen zu untersuchen. Wir haben die Hauptkomponenten ihres Prozesses angepasst, um die Rückgewinnung antigenspezifischer monoklonaler Antikörper aus einer Population von Speicher-B-Zellen zu ermöglichen, einschließlich der mehrstufigen Amplifikations-Primer-Strategie. Die wichtigste Modifikation ist die Zugabe von gekennzeichneten Antigen “Köder”. Es wurden zusätzliche Anpassungen an das veröffentlichte Protokoll vorgenommen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Modifizieren des Klonvektor-Rückgrats in ein einziges Expressionsplasmid, zusätzliche Primerabdeckung des Keimbahnrepertoires (sowohl Führungssequenz als auch Rahmen 1), Transfektion von Suspensions-HEK293-Zellen für eine höhere Expression und die Verwendung von Hochtreuepolymerasen während der PCR-Amplifikation.
Bei den hier beschriebenen Methoden befinden sich die wichtigsten Schritte in der Nähe des Übergangs zwischen Durchflusszytometrie und Einzelzellklonen. Zunächst ist die richtige Platzierung von sortierten Einzelzellen in die Platte unerlässlich. Die korrekte Einstellung der Drop-Delay auf der Sortiererin ist ein wichtiger Schritt. Umweltfaktoren wie niedrige Luftfeuchtigkeit müssen ebenfalls berücksichtigt werden, da wir festgestellt haben, dass unsere Wiederherstellungseffizienz deutlich abnimmt, es sei denn, auf den Zielsortierplatten wird ein statisches Geschütz verwendet. Nach der Zellplatzierung werden die Platten zentrifugiert, um sicherzustellen, dass die Zellen den Puffer von 10 L im Boden der Brunnen kontaktiert haben. Alle diese Maßnahmen sind entscheidend für den Erfolg des molekularbiologischen Teils. Wenn die Bedingungen für die Reverse-Transkriptionsreaktion einer einzelnen Zelle suboptimal sind, kann die PCR-Verstärkung von sogar dem Aktin schwierig sein. Die Stärke der vorgestellten Methode ist die Fähigkeit, Millionen von Zellen abzufragen und nur die Zellen zu sortieren, die den Antigen-Reaktivitätskriterien entsprechen, mit dem Antigen der Wahl. Dies erfordert, dass das Signal-Rausch-Verhältnis so hoch wie möglich ist, was durch die Optimierung der Köderkonzentrationen vor dem Sortieren geschieht. Dual-labeled Köder wird verwendet, um die Rückgewinnung von falsch-positiven Zellen zu reduzieren, die auftreten können, wenn einer der Fluorophore einen hohen Hintergrund hat. Die Verwendung von mehr als einem Antigenköder kann die Signal-Rausch-Optimierung erschweren, aber die Möglichkeit, mehrere Peptide gleichzeitig zu hinterfragt, ist ein weiterer Vorteil dieser Methode.
Wenn die Recovery-Effizienz gering ist, wird eine Reihe von verschachtelten ‘-Actin-Primern verwendet, um zu bestätigen, dass Vorlagen-cDNA vorhanden ist. Der Nachteil dieses Ansatzes ist, dass es schwierig ist, festzustellen, ob keine Zelle im Brunnen vorhanden war oder die umgekehrte Transkriptionsreaktion fehlgeschlagen ist, was die Fehlerbehebung erschwert. Gelegentlich tritt das Gegenteil auf, und die Effizienz ist höher als erwartet. Die typische Erholung für schwere Kette ist zwischen 30-45% und Leichte Ketten sind höher, zwischen 40-60%. Jede PCR-Reaktion (Schritt I & II) verwendet 50 Zyklen, um sich aus einer einzelnen Zelle zu verstärken. Die hohe Anzahl der Gesamtzyklen macht diese Methode auch anfällig für Verunreinigungen. Die Sequenzanalyse von Amplicons kann verwendet werden, um festzustellen, ob ein Schadstoff eingeführt wurde oder eine ungewöhnlich hohe Rückgewinnungsrate rechtmäßig erreicht wurde.
Der Nutzen dieser Methode, um native menschliche Antikörper gegen ein Antigen der Wahl zu erholen hat mehrere signifikante Einschränkungen. Erstens dürfen nur lösliche Proteine, die als “Köder” für die Durchflusszytometrie bezeichnet werden können, verwendet werden. Für die in den repräsentativen Ergebnissen dargestellten Sorten verwendeten wir eine Reihe synthetisierter überlappender Peptide aus Tau-Proteinen, da sich die Verwendung des gesamten Proteins als schwierig erwies. Die Verwendung linearer Peptide ist wahrscheinlich nicht optimal, da sie die Identifizierung von Antikörpern gegen nichtlineare oder strukturelle Epitope einschränken kann. Wir konnten jedoch mehrere eindeutige Antikörper gegen Tau identifizieren, die derzeit einer weiteren Bewertung unterzogen werden8,9. Eine weitere Einschränkung ist der geringe Durchsatz der molekularbiologischen Wiederherstellung und des Klonens von IgGs. Die anfängliche Sortierstrategie ermöglicht das Screening von Millionen von Zellen, aber die anschließende molekularbiologische Verarbeitung besteht aus mehreren Stufen. Die laufenden Optimierungsbemühungen zur Integration neuerer Technologien, wie Gibson Assembly10, haben mehrere Schritte optimiert, aber der Engpass bleibt das Klonen einzelner schwerer und leichter Kettenpaare.
Die “BSelex”-Methode verwendet die BCR, die auf der Oberfläche von Speicher-B-Zellen ausgedrückt wird, um Zellen zu identifizieren, die Antigenreaktivität anzeigen, und diese einzelnen Zellen dann über Diedurchflusszytometrie11,12wiederherzustellen. Aufgrund dieser Abhängigkeit vom BCR ist die Methode auf das Speicher-B-Zellkompartiment beschränkt und erfasst keine Antikörpersekretionszellen (ASCs) wie Plasmablasten. Dieser Ansatz kann jedoch vorteilhaft sein, um ein breiteres Repertoire an antigenspezifischen Immunglobinen im Vergleich zu ASCs wiederherzustellen. Grippeimpfstudien zeigen, dass reaktive ASCs zwar von einer kleinen Anzahl erweiterter B-Zellklone dominiert werden können, die antigenspezifische Memory-B-Zellpopulation jedoch selten klonalist 12. Der T-Zell-Rezeptor (TCR) auf der Oberfläche von T-Zellen besitzt Ähnlichkeiten mit dem B-Zell-Rezeptor in Genanordnung und Rekombination, um die Vielfalt zu maximieren. Einzelzellige Ansätze, die dem in der hier vorgestellten Methode ähneln, wurden zur Bewertung des T-Zellrepertoires entwickelt, einschließlich der Wiederherstellung und des einzelzelligen Klonens von Alpha- und Betaketten13. Die TCR-Erkennung erfordert jedoch, dass Peptide von MHC-Molekülen präsentiert werden, was den markierten Köderansatz zur Identifizierung peptidspezifischer T-Zellen erheblich erhöht. Im Gegensatz zu B-Zellen durchlaufen T-Zellen keine Affinitätsreifung des gesamten variablen Bereichs, so dass die Identifizierung des kurzen CDR3-Bereichs und eine flankierende Sequenz alles ist, was für die Identifizierung und Rekonstitution erforderlich ist. Schließlich beschreibt diese Methode die Identifizierung von IgG-Molekülen mittels Durchflusszytometrie, aber es ist auch möglich, alternative phänotypische Marker zu verwenden, um B-Zellen verschiedener Isotypen zu identifizieren.
Derzeit werden Methoden entwickelt, um die enorme Menge an Daten, die aus der Sequenzierung der nächsten Generation gesammelt werden, mit der funktionellen Analyse der Antigenspezifität zu verbinden, aber diese Methoden werden noch verfeinert. Trotz ihrer Einschränkungen wurde die hier beschriebene Methode verwendet, um Antikörper mit potenziellem therapeutischen Wert sowohl für infektiöse als auch für nicht-infektiöse Krankheitenzuidentifizieren 8,14,15, und stellt eine zuverlässige Ansatz zur Rückgewinnung relevanter antigenspezifischer IgGs vom Menschen, ohne umfassende Manipulation von B-Zellen oder umfangreiche Zellkultur.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia und Jeremy Macedo für die umfangreichen Tests vieler Methodenmodifikationen und die Verfeinerung der aktuellen BSelex-Plattform.
Materials
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
Referenzen
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