Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler
Summary
Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.
Abstract
Uzun kemikler karmaşık ve dinamik yapıları, bir kıkırdak ara yoluyla endokondral ossifikasyon ortaya çıkar. Sağlıklı insan kemiklerine sınırlı erişim, özellikle kemik büyümesi ve homeostasis farklı yönlerini bakmak için, fare ve sıçan gibi memeliler modellerinin kullanımı değerli hale getirir. Ayrıca, fareler içinde sofistike genetik araçların geliştirilmesi uzun kemik büyümesi daha karmaşık çalışmalar sağlar ve kemik büyümesini incelemek için kullanılan tekniklerin bir genişleme ister. Burada, ex vivo murine kemik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da kemik ve kıkırdak araştırmasına sıkı kontrollü bir şekilde izin verirken, in vivo sürecinin çoğunu yeniden özetleyin. Tarif edilen yöntem, Tibia, femur ve Metatarsal kemikler de dahil olmak üzere bir dizi kemik kültürünü sağlar, ancak burada esas olarak tibial kültüre odaklanıyoruz. Dahası, zaman aşımı canlı görüntüleme veya ilaç tedavisi gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.
Introduction
Organ büyümesi, büyüme bozukluklarının görünümünü önlemek için sıkı bir şekilde ayarlanmalıdır ve vücudun farklı bölgelerinde birden fazla hücre tipi, moleküler yol ve Crosstalk düzenlenmesi içerir. Görüntüleme teknikleri, zaman içinde büyüyen bir embriyo içinde meydana gelen değişiklikleri ele almak için esastır, hem normal koşullarda, hem de bir pertürasyon sonra sistemde indüklenir. Yaygın olarak kullanılan kemirgen modelleri gibi intrauterin gelişimi ile embriyolar, ex vivo kültür tekniklerini kullanarak kısmen üstesinden gelebilmek için canlı görüntüleme ve ilaç tedavisi için ek bir zorluk sunar. İn vivo süreçlerin başarıyla reapitasyon ve anlamlı sonuçlar elde etmek için, her organ veya doku için doğru kültür koşullarını bulmak için çok önemli olur.
Memelinin iskelet çoğu kemikleri endokondral ossifikasyon ile büyür, burada embriyonik kıkırdak (kondrositler denilen hücrelerden oluşan) uzunlamasına büyüme sürücü ve kademeli olarak kemik değiştirilir. Bu süreç, üç bölge ayırt edilebilir uzun kemikler, sonunda bulunan büyüme plakaları, olur: dinlenme, proliferatif ve hipertrofik1,2. İlk olarak, dinlenme bölgesinde yuvarlak progenitör kondositler proliferatif bölgede bisiklet sütunlu kondositler içine geçiş. Farklılaşma bir sonraki aşamasında, bu kondrositler hipertrofik haline gelir ve tip X kollajen salgıcı başlar. Hipertrofik kondrositler ossifikasyon sonraki adımlarını düzenler: Bunlar bağlantı dokusu büyüme faktörü, kemik morfogenetik proteinler ve Hint kirpi gibi anahtar sinyalizasyon moleküllerini salgılaştırır ve matrisin mineralizasyonu doğrudan, işe kemiğin orta kısmına kan damarlarının, ve, apoptozis üzerine, osteoblastlar izin (kemik şekillendirme hücreleri) Primer ossifikasyon merkezi oluşturmak için matris istila etmek3,4. Mineralize matris, Osteoblastların bir kemik matrisiyle bu bozulmuş kıkırdak yerine göç ettiği kan damarlarının nüfuz etmesini kolaylaştırır5. Çoğu osteoblastlar perikhondrium kıkırdak matris istila, kıkırdak sarar fibröz bir tabaka6. Alternatif olarak, hipertrofik kondrositlerin bir oranı, osteoblastlar7,8,9‘ a karşı hayatta kalabilecektir. Kemiğin son uzunluğu, büyüme oranı hipertrofik kondrositlerin sayısına ve boyutuna ve matris üretimini10‘ a bağlı olan geçici kıkırdak birikiminin kaynaklanmaktadır. Ayrıca, son hipertrofisi aşamasının süresinin, kemik11‘ in son uzunluğu ile ilişkili olduğu son zamanlarda gösterildi. Bu nedenle, uygun kemik boyutunu sağlamak için bu hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşma sıkı düzenleme gereklidir.
Büyüme plakalarının örgütlenmesi ve geliştirilmesi konusunda yıl içinde elde edilen önemli bilgiye rağmen, bu sonuçların çoğu sabit histolojik bölümlerin gözlemlenmesi üzerine kuruludur. Doku bölümleme bu süreç hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak teknik eserler ile basılabilir, bu nedenle her zaman güvenilir farklı aşamaları arasında morfolojik veya boyutu değişiklikleri tahmin etmek için kullanılamaz. Ayrıca, kemik büyümesi dinamik bir süreçtir, statik iki boyutlu (2D) görüntüler büyüme plakasında hücrelerin hareketi içine sınırlı bir anlayış sunar, canlı doku zaman atlamalı görüntüleme davranışı hakkında değerli bilgiler sunabilir iken kondrocytes büyüme plakası.
Tüm bu sınırlamalar ex vivo kemik kültürlerini kullanarak potansiyel olarak çözülebilir. Kemik kültürü protokolleri bir süre önce geliştirilirken, duvar uzun kemiklere sınırsız olarak uygulanmıştır. Çalışmaların çoğu Chick modeli12,13tarafından sunulan teknik avantajları nedeniyle civciv kemikleri kullanın. Organotypic kültürler (hava/sıvı arayüz), 10 gün14için kültürde tutulan Chick embriyonik femurs, uygulandı. Mouse ‘ta bulunan sofistike genetik araçlar bu modeli ex vivo kemik kültüründe kullanılmak üzere çok cazip hale getirmek. Fareler kemik büyümesi bakmak için kullanılan çalışmalar Metatarsal kemikler ile çoğunlukla çalıştı15, muhtemelen küçük boyutu ve daha büyük sayılar embriyo başına elde nedeniyle16. Geleneksel olarak uzun kemikler olarak kabul rağmen, metatarsi (azalan proliferasyon ve büyüme plakası17) daha önce diğer uzun kemikler içinde vivo ile karakterize ve bu nedenle sürekli büyüme ex vivo değil, yaşlanma girin Gerçekten in vivo süreci özetlemek. Bu makalenin amaçları için, proksimal ve ara ekstremite bölgelerden kemikler için uzun kemikler terimi kullanacağız. Birkaç önceki çalışmalar, Tibia gibi uzun murine kemikleri, ex vivo kültürlerde kullanılan ve kıkırdak ama küçük ossifikasyon önemli bir büyüme gözlenen18. Ayrıca son zamanlarda, özellikle kondrosit dinamikleri19çalışma tibial kültürler kullanılır. Diğer çalışmalar genç fareler20 ya da sadece kültür21için femur distal kısmı femoral kafaları kullandı. Bazı daha yeni eserler başarıyla üç boyutlu (3D) kondrocytes filmleri canlı fare dokusu22,23elde etmek için zaman atlamalı görüntüleme ile tam kemik ex vivo kültürü birleştirir. Yazarlar, kemik ex vivo kültürünün potansiyel uygulama iyi bir örnek proliferatif bölge23 kondrositlerin yeniden düzenlenmesi daha önce fark edilmemiş olayları gözlemlemek başardı. Alternatif, yani, statik görüntüleri analiz, dolaylı ve karmaşık teknikler gerektirir. Bu kıkırdak büyüme için transversally odaklı klonlar önemini değerlendirmek son bir çalışma tarafından örneklenmiştir, matematiksel modelleme ile birleştiğinde çok renkli muhabir fare suşları ile genetik izleme kullanıldı24. Bu nedenle, ex vivo kültür daha hızlı ve daha basit bir şekilde dinamik süreçlere anlayış elde etmenize yardımcı olabilir.
Burada, farklı moleküler tedaviler ve/veya zaman aşımı canlı görüntüleme ile kombine edilebilir murine uzun kemikler kültürü için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol15,18,25önceki raporlarda kullanılan yöntemleri uyarlar, ancak bazı ek sorunları giderir ve uzun kemikler gibi Tibia, Metatarsal kemikler yerine odaklanır. Son olarak, farklı maddelerin varlığını ayrı olarak sol ve sağ kemikler kültür tarafından istatistiksel olarak güçlü eşleştirilmiş karşılaştırmalar kullanma potansiyelini araştırıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemik ex vivo kültür yöntemleri, kemik büyümesi28biyolojisi değerlendirmek için bir süre kullanılmıştır, ancak nadiren murine uzun kemikler uygulanmıştır. Görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile ex vivo kemik kültürü, in vivo koşullarına yakından benzeyen bir ortamda kemik büyümesini gerçek zamanlı olarak incelemek için cazip bir yol sunar. Bu senaryoda, uzun kemiklerin büyümesini in vivo kendi büyüme karşılaştırılabilir koşulları tanımlamak önemlidi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu protokol kuruldu onun desteği için Alexandra Joyner teşekkür etmek istiyorum, Edwina McGlinn ve yi-Cheng Chang retinoik asit paylaşımı için. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria devlet hükümeti ve Avustralya hükümeti hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2-mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
Referenzen
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
