Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

La crescita degli organi deve essere strettamente sintonizzata per prevenire la comparsa di disturbi della crescita, e coinvolge la regolazione di diversi tipi di cellule, vie molecolari e crosstalk tra diverse parti del corpo. Le tecniche di imaging sono essenziali per affrontare i cambiamenti che si verificano nel corso del tempo in un embrione in crescita, sia in condizioni normali, così come dopo una perturbazione è indotta nel sistema. Gli embrioni con sviluppo intrauterino, come i modelli di roditori ampiamente utilizzati, presentano una sfida aggiuntiva per l’imaging dal vivo e il trattamento farmacologico, che può essere parzialmente superato utilizzando tecniche di coltura ex vivo. Per ricapitolare con successo i processi in vivo e ottenere risultati significativi, diventa cruciale trovare le giuste condizioni di coltura per ogni organo o tessuto.

La maggior parte delle ossa dello scheletro dei mammiferi crescono attraverso l’ossificazione endocondrale, dove la cartilagine embrionale (composta da cellule chiamate condrociti) spinge la crescita longitudinale e viene gradualmente sostituita dall’osso. Questo processo avviene alle piastre di crescita, situate alla fine delle ossa lunghe, dove si distinguono tre zone: riposo, proliferativo e ipertrofico^1,2. In primo luogo, i condrociti progenitrici rotondi nella zona di riposo transitano nei condrociti colonnari ciclistici nella zona proliferativa. Durante la successiva fase di differenziazione, questi condrociti diventano ipertrofici e iniziano a secchire il collagene di tipo X. I condrociti ipertrofici orchestrano le fasi successive di ossificazione: secernono molecole di segnalazione chiave, come il fattore di crescita del tessuto connettivo, le proteine morfogenetiche ossee e il riccio indiano, e dirigono la mineralizzazione della matrice, reclutano vasi sanguigni alla parte centrale dell’osso, e, su apoptosi, consentire osteoblasti (cellule che formano ossa) per invadere la matrice per formare il centro di ossificazione primaria^3,4. La matrice mineralizzata facilita la penetrazione dei vasi sanguigni attraverso i quali gli osteoblasti migrano per sostituire questa cartilagine degradata con una matrice ossea⁵. La maggior parte degli osteoblasti invade la matrice cartilaginea dal perichdri, uno strato fibusto che avvolge la cartilagine⁶. In alternativa, una proporzione di condrociti ipertrofici è in grado di sopravvivere e di trasdifferenziarsi agli osteoblasti^7,8,9. La lunghezza finale dell’osso è dovuta alla crescita accumulata della cartilagine transitoria, il cui tasso di crescita a sua volta dipende dal numero e dalle dimensioni dei condrociti ipertrofici e dalla loro produzione di matrici¹⁰. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la durata dell’ultima fase dell’ipertrofia è correlata alla lunghezza finale dell’osso¹¹. Pertanto, è necessaria una stretta regolazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule per garantire la corretta dimensione ossea.

Nonostante le conoscenze sostanziali acquisite nel corso degli anni sull’organizzazione e lo sviluppo delle piastre di crescita, la maggior parte di queste conclusioni si basano sull’osservazione delle sezioni istologiche fisse. Il sezionamento dei tessuti fornisce informazioni preziose su questo processo, ma può essere guidato con artefatti tecnici, quindi non può essere sempre utilizzato in modo affidabile per stimare i cambiamenti morfologici o dimensionali tra le diverse fasi. Inoltre, poiché la crescita ossea è un processo dinamico, le immagini statiche bidimensionali (2D) offrono una visione limitata del movimento delle cellule nella piastra di crescita, mentre l’imaging time-lapse sul tessuto vivo potrebbe offrire informazioni preziose sul comportamento del condrociti nella piastra di crescita.

Tutte queste limitazioni possono essere potenzialmente risolte utilizzando colture ossee ex vivo. Mentre i protocolli di coltura ossea sono stati sviluppati qualche tempo fa, sono stati limitatamente applicati alle ossa lunghe murine. La maggior parte degli studi usa le ossa delle pollastrelle a causa dei vantaggi tecnici offerti dal pulcino modello^12,13. Le colture organotipiche (interfaccia aria/liquido) sono state applicate ai femori embrionali di pulcino, che sono stati mantenuti in coltura per 10 giorni¹⁴. I sofisticati strumenti genetici disponibili nel topo rendono questo modello molto attraente per essere utilizzato nella coltura ossea ex vivo. Gli studi che hanno usato i topi per esaminare la crescita ossea hanno funzionato principalmente con le ossa metatarsali¹⁵, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni e dei numeri maggiori ottenuti per embrione¹⁶. Sebbene tradizionalmente considerate ossa lunghe, metatarsi entrano in senescenza (caratterizzata da ridotta proliferazione e involuzione della piastra di crescita¹⁷) prima di altre ossa lunghe in vivo, e quindi la loro continua crescita ex vivo non davvero ricapitolare il processo in vivo. Ai fini di questo articolo, useremo il termine ossa lunghe per le ossa delle regioni degli arti prossimali e intermedie. Diversi studi precedenti hanno usato ossa lunghe murine, come la tibia, in colture ex vivo e osservato una crescita sostanziale della cartilagine, ma poca ossificazione¹⁸. Abbiamo anche usato le colture tibiali recentemente, principalmente per studiare la dinamica dei condrociti¹⁹. Altri studi hanno usato teste femorali da giovani topi²⁰ o solo la parte distale del femore per la cultura²¹. Alcune opere più recenti combinano con successo la cultura ex vivo di ossa piene con imaging time-lapse per acquisire film tridimensionali (3D) di condrociti nel tessuto vivente del topo^22,23. Gli autori sono riusciti ad osservare eventi precedentemente inosservati nel riarrangiamento dei condrociti alla zona proliferativa²³ in un buon esempio della potenziale applicazione della coltura ossea ex vivo. L’alternativa, cioè l’analisi delle immagini statiche, richiede tecniche indirette e complesse. Questo è stato esemplificato da un recente studio che ha valutato l’importanza di cloni orientati alla trasversalmente per la crescita della cartilagine, dove il tracciamento genetico con ceppi di topo reporter multicolore accoppiato con la modellazione matematica sono stati utilizzati²⁴. Pertanto, la cultura ex vivo potrebbe contribuire a ottenere informazioni sui processi dinamici in modo più rapido e diretto.

Qui, presentiamo un metodo per la cultura ossea lunga murina, che può essere combinata con diversi trattamenti molecolari e/o con Time-lapse Live Imaging. Questo protocollo adatta i metodi utilizzati nelle precedenti relazioni^15,18,25, ma affronta alcuni problemi aggiuntivi e si concentra su ossa lunghe come la tibia, piuttosto che le ossa metatarsali. Infine, Esplora il potenziale dell’utilizzo di confronti associati statisticamente potenti Culturando le ossa sinistra e destra separatamente in presenza di diverse sostanze.