Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

O crescimento de órgãos tem de ser firmemente afinado para evitar o aparecimento de distúrbios de crescimento, e envolve a regulação de vários tipos de células, vias moleculares e conversa cruzada entre diferentes partes do corpo. Técnicas de imagem são essenciais para abordar as mudanças que ocorrem ao longo do tempo em um embrião em crescimento, tanto em condições normais, bem como após uma perturbação é induzida no sistema. Embriões com desenvolvimento intrauterino, como os modelos de roedores amplamente utilizados, apresentam um desafio adicional para a imagem ao vivo e tratamento medicamentoso, que pode ser parcialmente superado pelo uso de técnicas de cultura ex vivo. Para recapitular com sucesso os processos in vivo e obter resultados significativos, torna-se crucial encontrar as condições de cultivo certas para cada órgão ou tecido.

A maioria dos ossos do esqueleto de mamíferos cresce através da ossificação endocondral, onde a cartilagem embrionária (composta de células denominadas condrócitos) impulsiona o crescimento longitudinal e é gradualmente substituída pelo osso. Esse processo ocorre nas placas de crescimento, localizadas no final dos ossos longos, onde três zonas podem ser distinguidas: repouso, proliferativa e hipertrófica^1,2. Primeiramente, os condrócitos redondos do progenitoras na transição da zona descansando nos condrócitos colunar de ciclagem na zona proliferative. Durante a fase seguinte da diferenciação, estes condrócitos tornam-se hipertrófica e começam secretoras o tipo colagénio de X. Os condrócitos hipertróficos orquestram as etapas subsequentes da ossificação: secretam moléculas-chave de sinalização, como fator de crescimento do tecido conjuntivo, proteínas morfogenéticas ósseas e ouriço indiano, e dirigem a mineralização da matriz, recrutam os vasos sanguíneos para a parte central do osso, e, após a apoptose, permitem osteoblastos (células formadoras de osso) para invadir a matriz para formar o centro de ossificação primária^3,4. A matriz mineralizada facilita a penetração dos vasos sanguíneos através dos quais os osteoblastos migram para substituir esta cartilagem degradada por uma matriz óssea⁵. A maioria dos osteoblastos invade a matriz cartilaginosa do pericôndrio, uma camada fibrosa que envolve a cartilagem⁶. Alternativamente, uma proporção de condrócitos hipertróficos é capaz de sobreviver e transdiferenciar a osteoblastos^7,8,9. O comprimento final do osso é devido ao crescimento acumulado da cartilagem transitória, cuja taxa de crescimento por sua vez depende do número e tamanho dos condrócitos hipertróficos, e sua produção matricial¹⁰. Adicionalmente, foi demonstrado recentemente que a duração da última fase de hipertrofia correlaciona-se com o comprimento final do osso¹¹. Conseqüentemente, a regulação apertada da proliferação e da diferenciação destas pilhas é exigida para assegurar o tamanho apropriado do osso.

Apesar do conhecimento substancial adquirido ao longo dos anos sobre a organização e o desenvolvimento das placas de crescimento, a maioria destas conclusões baseiam-se na observação de secções histológicas fixas. O corte de tecidos fornece informações valiosas sobre esse processo, mas pode ser montado com artefatos técnicos, por isso não pode ser sempre confiável usado para estimar alterações morfológicas ou de tamanho entre diferentes estágios. Adicionalmente, porque o crescimento do osso é um processo dinâmico, as imagens bidimensionais (2D) estáticas oferecem uma introspecção limitada no movimento das pilhas na placa do crescimento, quando a imagem latente do tempo-lapso no tecido vivo poderia oferecer a informação valiosa no comportamento do condrócitos na placa de crescimento.

Todas essas limitações podem ser potencialmente resolvidas usando culturas ósseas ex vivo. Quando os protocolos da cultura do osso forem desenvolvidos alguma hora há, foram aplicados limitadamente aos ossos longos murino. A maioria dos estudos utiliza ossos de pintinhos devido às vantagens técnicas oferecidas pelo modelo de pintainho^12,13. Culturas organotípicas (interface ar/líquido) foram aplicadas a fêmures embrionárias de pintinhos, mantidas em cultura por 10 dias¹⁴. As sofisticadas ferramentas genéticas disponíveis no mouse tornam este modelo muito atraente para ser usado na cultura óssea ex vivo. Os estudos que utilizaram camundongos para olhar para o crescimento ósseo trabalharam principalmente com os ossos do metatarso¹⁵, provavelmente devido ao seu tamanho pequeno e maiores números obtidos por embrião¹⁶. Embora tradicionalmente considerados ossos longos, metatarsos entram em senescência (caracterizada pela redução da proliferação e involução da placa de crescimento¹⁷) mais cedo do que outros ossos longos in vivo, e, portanto, o seu crescimento contínuo ex vivo não realmente recapitular o processo in vivo. Para os propósitos deste artigo, usaremos o termo ossos longos para ossos das regiões proximal e intermediária do membro. Vários estudos prévios utilizaram ossos murinos longos, como a tíbia, em culturas ex vivo e observaram um crescimento substancial da cartilagem, mas pouca ossificação¹⁸. Também utilizamos culturas tibiais recentemente, principalmente para estudar a dinâmica do condrócitos¹⁹. Outros estudos utilizaram cabeças femorais de camundongos jovens²⁰ ou apenas a parte distal do fêmur para cultura²¹. Alguns trabalhos mais recentes combinam com sucesso a cultura ex vivo de ossos cheios com imagens de lapso temporal para adquirir filmes tridimensionais (3D) de condrócitos em tecido vivo de camundongo^22,23. Os autores conseguiram observar eventos previamente despercebidos no rearranjo de condrócitos para a zona proliferativa²³ em um bom exemplo da potencial aplicação da cultura óssea ex vivo. A alternativa, ou seja, analisando imagens estáticas, requer técnicas indiretas e complexas. Isto foi exemplificado por um estudo recente avaliando a importância de clones transgénicos orientados para o crescimento da cartilagem, onde o traçado genético com cepas multicolor do rato do repórter acoplados com modelagem matemática foi usado²⁴. Portanto, a cultura ex vivo pode ajudar a obter insights sobre processos dinâmicos de forma mais rápida e direta.

Aqui, nós apresentamos um método para a cultura longa dos ossos murino, que pode ser combinada com os tratamentos moleculars diferentes e/ou com imagem latente viva do tempo-lapso. Este protocolo adapta os métodos utilizados nos relatórios anteriores^15,18,²⁵, mas aborda alguns problemas adicionais e se concentra em ossos longos, como a tíbia, ao invés de ossos metatarsais. Por fim, explora o potencial do uso de comparações pareadas estatisticamente poderosas, cultivando ossos esquerdos e direitos separadamente na presença de diferentes substâncias.