Die Kultivierung und Messung von Fetalen und Neugeborenen Murine Long Bones

Das Organwachstum muss eng abgestimmt werden, um das Auftreten von Wachstumsstörungen zu verhindern, und beinhaltet die Regulierung mehrerer Zelltypen, molekularer Wege und Kreuzungen zwischen verschiedenen Körperteilen. Bildgebende Techniken sind unerlässlich, um die Veränderungen zu bewältigen, die im Laufe der Zeit in einem wachsenden Embryo auftreten, sowohl unter normalen Bedingungen, als auch nach einer Störung, die im System induziert wird. Embryonen mit intrauterinischer Entwicklung, wie die weit verbreiteten Nagetiermodelle, stellen eine zusätzliche Herausforderung für die Live-Bildgebung und die medikamentöse Behandlung dar, die teilweise durch den Einsatz von Ex-vivo-Kulturtechniken bewältigt werden kann. Um die In-vivo-Prozesse erfolgreich zu rekapitulieren und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, die richtigen kultivierenden Bedingungen für jedes Organ oder Gewebe zu finden.

Die meisten Knochen des Säugetierskeletts wachsen durch endochondrale Verknöcherung, wo der embryonale Knorpel (bestehend aus Zellen, die Chondrozyten genannt werden) das Längswachstum antreibt und nach und nach durch Knochen ersetzt wird. Dieser Prozess geschieht an den Wachstumsplatten, die sich am Ende der langen Knochen befinden, wo drei Zonen unterschieden werden können: Ruht, proliferativ und hypertrophisch^1,2. Zunächst die runden Vorläuferchchen in der Ruhezone Übergang in die Radspalnar chondrozyten in der proliferativen Zone. In der nächsten Phase der Differenzierung werden diese Chondrozyten hypertrophisch und beginnen, Typ X Kollagen zu spülen. Hypertrophe Chondrozyten orchestrieren die folgenden Schritte der Verknöcherung: Sie scheiden Schlüsselsignalmoleküle aus, wie Bindegewebswachstumsfaktor, Knochenmorphogenetische Proteine und indischer Igel, und lenken die Mineralisierung der Matrix, rekrutieren Die Blutgefäße bis zum zentralen Teil des Knochens, und nach der Apoptose,^erlaubenOsteoblasten (Knochenbildende Zellen), in die Matrix einzudringen, umdie primäre Verknöcherung Zentrum 3,4^zubilden. Die mineralisierte Matrix erleichtert das Eindringen von Blutgefäßen, durch die Osteoblasten wandern, um diesen abgebauten Knorpel durch eine Knochenmatrix⁵zu ersetzen. Die meisten Osteoblasten dringen in die Knorpelmatrix aus dem Perichondrium ein, einer Faserschicht, die den Knorpel 6 umhüllt. Alternativ kann ein Anteil hypertrophischer Chondrozyten überleben und sich zu Osteoblasten7,8,9 transdifferenzieren. Die endgültige Länge des Knochens ist auf das angesammelte Wachstum des flüchtigen Knorpels zurückzuführen, dessen Wachstumsrate wiederum von der Anzahl und Größe der hypertrophen Chondrozyten und ihrer Matrixproduktion10 abhängt. Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass die Dauer der letzten Hypertrophie-Phase mit der letzten Länge des Knochens 11korreliert. Daher ist eine strenge Regulierung der Proliferation und Differenzierung dieser Zellen erforderlich, um die richtige Knochengröße zu gewährleisten.

Trotz des umfangreichen Wissens, das im Laufe der Jahre über die Organisation und Entwicklung der Wachstumsplatten erworben wurde, basieren die meisten dieser Schlussfolgerungen auf der Beobachtung von festen histologischen Abschnitten. Die Abtrennung von Gewebeabschnitten liefert wertvolle Informationen über diesen Prozess, kann aber mit technischen Artefakten geritten werden, so dass es nicht immer zuverlässig verwendet werden kann, um morphologische oder Größenänderungen zwischen verschiedenen Stadien zu schätzen. Da das Knochenwachstum ein dynamischer Prozess ist, bieten die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder einen begrenzten Einblick in die Bewegung der Zellen in der Wachstumsplatte, während Zeitraffer-Abbildungen auf lebendem Gewebe wertvolle Informationen über das Verhalten der Chondrozyten in der Wachstumsplatte.

All diese Einschränkungen können mit Ex-vivo-Knochenkulturen gelöst werden. Während die Knochenkulturprotokolle schon vor einiger Zeit entwickelt wurden, wurden sie auf Murine-lange Knochen limitiert. Die meisten Studien verwenden die Kichererbse aufgrund der technischen Vorteile, die das Kickmodell 12^,13bietet. Organotypische Kulturen (air/liquide Schnittstelle) wurden auf schicke embryonale Oberschenkel angewendet, die 10 Tage lang in der Kulturgepflegt wurden 14. Die ausgeklügelten genetischen Werkzeuge, die in der Maus zur Verfügung stehen, machen dieses Modell sehr attraktiv, um in der ex vivo Knochenkultur verwendet werden. Die Studien, die Mäuse benutzten, um das Knochenwachstum^zuuntersuchen, arbeiteten hauptsächlich mit Metatarsal-Knochen 15, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Größeund größeren Anzahl pro Embryo 16. Obwohl traditionell als lange Knochen betrachtet, Metatarsi in die Seneszenz (gekennzeichnet durch reduzierte Vermehrung und Involvierung der Wachstumsplatte 17) früher als andere lange Knochen in vivo, und daher ihr kontinuierliches Wachstum ex vivo nicht Rechreibe der In-vivo-Prozess wirklich. Für die Zwecke dieses Artikels werden wir den Begriff lange Knochen für Knochen aus den Regionen der proximalen und mittleren Gliedmaßen verwenden. Mehrere frühere Studien verwendeten lange Murinknochen, wie Tibia, in Ex-vivo-Kulturen und beobachteten ein erhebliches Wachstum des Knorpels, aber wenig Verknöcherung 18. Wir haben in letzter Zeit auch tibiale Kulturen verwendet, vor allem, um die Chondrozyten-Dynamik^{zu studieren 19}. Andere Studien verwendeten Oberschenkelköpfe von jungen Mäusen 20 oder nur den distalen Teil des Oberschenkels für Kultur²¹. Einige neuere Arbeiten verbinden erfolgreich die ex vivo-Kultur der vollen Knochen mit Zeitraffer-Bildgebung, um dreidimensionale (3D) Filme von Chondrozyten im lebendenMausgewebe 22,23^zuerwerben. Den Autoren gelang es, bisher unbemerkte Ereignisse bei der Neuordnung der Chondrozyten in die proliferative Zone²³ zu beobachten, in einem guten Beispiel für die mögliche Anwendung der Knochen-Ex-vivo-Kultur. Die Alternative, also die Analyse statischer Bilder, erfordert indirekte und komplexe Techniken. Dies wurde durch eine aktuelle Studie veranschaulicht, die die Bedeutung von transversal orientierten Klonen für das Knorpelwachstum bewertet, bei der die genetische Verfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen in Verbindung mit mathematischer Modellierung 24 verwendet wurde^. Daher könnte die ex vivo-Kultur dazu beitragen, schneller und unkomplizierter Einblicke in dynamische Prozesse zu gewinnen.

Hier stellen wir eine Methode zur Murine-Langknoch-Kultur vor, die mit verschiedenen molekularen Behandlungen und/oder mit Zeitraffer-Live-Bildgebung kombiniert werden kann. Dieses Protokoll passt die Methoden an, die in früheren Berichten^15,18,25verwendet werden, spricht aber einige zusätzliche Probleme an und konzentriert sich auf lange Knochen wie die Tibia und nicht auf metatarsale Knochen. Schließlich untersucht sie das Potenzial, statistisch starke Paßvergleiche zu verwenden, indem sie linke und rechte Knochen getrennt in Anwesenheit verschiedener Substanzen kultiviert.