Organ tillväxt måste vara tätt trimmad för att förhindra uppkomsten av tillväxtstörning, och innebär reglering av flera cell typer, molekyl ära vägar och överhörning mellan olika delar av kroppen. Imaging tekniker är avgörande för att hantera de förändringar som sker över tiden i ett växande embryo, både under normala förhållanden, samt efter en störning framkallas i systemet. Embryon med intrauterin utveckling, såsom de allmänt använda gnagare modeller, presentera en ytterligare utmaning för Live Imaging och läkemedels behandling, som delvis kan övervinnas genom att använda ex vivo kultur tekniker. För att framgångs rikt återkapitulera in vivo-processerna och få meningsfulla resultat blir det avgörande att hitta rätt odlings förhållanden för varje organ eller vävnad.

De flesta benen i däggdjurs skelettet växer genom endochondral ossifiering, där embryonala brosk (som består av celler som kallas kondrocyter) driver longitudinell tillväxt och gradvis ersätts av ben. Denna process sker vid tillväxt plattorna, som ligger i slutet av de långa benen, där tre zoner kan särskiljas: vila, proliferativ, och hypertrofisk^1,2. Först, den runda stamceller kondrocyter i vilo zonen över gång till cykling kolumner kondrocyter i proliferativa zonen. Under nästa steg av differentiering, dessa kondrocyter blir hypertrofiska och börja utsöndra typ X kollagen. Hypertrofiska kondrocyter iscensätter efterföljande steg av ossifiering: de utsöndrar viktiga signal molekyler, såsom bindväv tillväxtfaktor, ben morfogenetiska proteiner och indisk igelkott, och direkt mineraliseringen av matrisen, rekrytera blod kärlen till den centrala delen av benet, och, vid apoptos, tillåta osteoblaster (ben-bildande celler) att invadera matrisen för att bilda den primära ben bildning Center^3,4. Den mineraliserade matrisen underlättar inträngning av blod kärl genom vilka osteoblaster migrerar för att ersätta detta försämrade brosk med en benmatrix⁵. De flesta osteoblaster invaderar brosk matrisen från perichondrium, ett fibrösa skikt som sveper in brosket⁶. Alternativt kan en andel av hypertrofiska kondrocyter överleva och transdifferentiera till osteoblaster^7,8,9. Den slutliga längden på benet beror på den ackumulerade tillväxten av övergående brosk, vars tillväxt takten i sin tur beror på antalet och storleken på de hypertrofiska kondrocyter, och deras matris produktion¹⁰. Dessutom, det var nyligen visat att varaktigheten av den sista hypertrofi fas korrelerar med den sista längden av benet¹¹. Därför, stram reglering av spridning och differentiering av dessa celler krävs för att säkerställa korrekt ben storlek.

Trots de betydande kunskaper som förvärv ATS under årens lopp på organisering och utveckling av tillväxt plattorna, är de flesta av dessa satser baserade på observation av fasta histologiska avsnitt. Vävnads snittning ger värdefull information om denna process, men kan köras med tekniska artefakter, så det kan inte alltid tillförlitligt användas för att uppskatta morfologiska eller storleks förändringar mellan olika stadier. Dessutom, som ben tillväxt är en dynamisk process, de statiska tvådimensionella (2D) bilder erbjuder en begränsad inblick i förflyttning av cellerna i tillväxt plattan, medan time-lapse Imaging på levande vävnad kan erbjuda värdefull information om beteendet hos chondrocyter i tillväxt plattan.

Alla dessa begränsningar kan potentiellt lösas med ex vivo ben kulturer. Medan ben kultur protokoll har utvecklats för en tid sedan, var de limiterat tillämpas på murina långa ben. De flesta av studierna använder chick Bones på grund av de tekniska fördelar som erbjuds av chick modell^12,13. Organotypiska kulturer (luft/flytande gränssnitt) tillämpades på chick embryonala femurs, som upprätthölls i kulturen i 10 dagar¹⁴. Den sofistikerade genetiska verktyg som finns i musen gör denna modell mycket tilltalande att användas i ex vivo ben kultur. De studier som använde möss för att undersöka ben tillväxt fungerade mest med metatarsala ben¹⁵, troligen på grund av sin ringa storlek och större antal erhållits per embryo¹⁶. Även traditionellt anses långa ben, metatarsi ange åldras (kännetecknas av minskad proliferation och Involution av tillväxt plattan¹⁷) tidigare än andra långa ben in vivo, och därför deras kontinuerliga tillväxt ex vivo inte verkligen upprepa in vivo-processen. Vid tillämpningen av denna artikel, vi kommer att använda termen långa ben för ben från proximala och mellanliggande extremiteterna regioner. Flera tidigare studier används långa murina ben, såsom Tibia, i ex vivo kulturer och observerade en betydande ökning av brosk men liten ben bildning¹⁸. Vi använde också Tibia kulturer nyligen, främst för att studera chondrocyte Dynamics¹⁹. Andra studier används femurhuvuden från unga möss²⁰ eller bara den distala delen av lårbenet för kultur²¹. Några nyare arbeten framgångs rikt kombinera ex vivo kultur full ben med time-lapse Imaging att förvärva tredimensionella (3D) filmer av kondrocyter i levande mus vävnad^22,23. Författarna lyckades Observera tidigare obemärkt händelser i omplaceringen av chondrocyter till proliferativ zon²³ i ett bra exempel på den potentiella tillämpningen av ben ex vivo kultur. Alternativet, d.v.s. analysera statiska bilder, kräver indirekta och komplexa tekniker. Detta exemplifierades av en färsk studie som utvärderar betydelsen av transversally-orienterade kloner för brosk tillväxt, där genetisk spårning med multicolor reporter mus stammar i kombination med matematisk modellering användes²⁴. Därför kan ex vivo-kulturen hjälpa till att få insikt i dynamiska processer på ett snabbare och enklare sätt.

Här presenterar vi en metod för murina långa ben kultur, som kan kombineras med olika molekyl ära behandlingar och/eller med time-lapse Live Imaging. Detta protokoll anpassar de metoder som används i tidigare rapporter^15,18,25, men tar upp några ytterligare frågor och fokuserar på långa ben såsom Tibia, snarare än metatarsala ben. Slutligen undersöker den potentialen att använda statistiskt kraftfulla Parade jämförelser genom odling av vänster och höger ben separat i närvaro av olika substanser.