臓器の成長は、成長障害の出現を防ぐために厳密に調整されなければならない、と体の異なる部分間の複数の細胞型、分子経路およびクロストークの調節を伴う。イメージング技術は、成長している胚において経時的に起こる変化に対処するために不可欠であり、正常な状態においても、またシステムにおいて摂動が誘発された後も同様である。子宮内発育を伴う胚は、広く使用されているげっ歯類モデルのような、生きた画像化および薬物治療のための追加の課題を提示し、これは ex vivo 培養技術を使用して部分的に克服することができる。インビボプロセスを正常に不在し、有意義な結果を得るためには、各器官または組織に対して適切な培養条件を見つけることが重要となる。

哺乳類の骨格のほとんどの骨は endochondral 骨化を通じて成長し、そこでは胚性軟骨 (軟骨細胞と呼ばれるセルで構成される) が長手方向の成長を駆動し、徐々に骨に置換される。このプロセスは、長い骨の末端に位置する成長プレートで発生します, 3 つのゾーンを区別することができます: 安静, 増殖性, 肥大と^1,2.第1に、安静域における丸い前駆軟骨は、増殖性ゾーンにおいて循環柱状軟骨細胞へと移行する。分化の次の段階では、これらの軟骨細胞は肥厚性になり、タイプ X コラーゲンを分泌し始めます。肥大性軟骨細胞は骨化の後続のステップを調整します: 結合組織成長因子、骨形態形成タンパク質、インドヘッジホッグなどの主要なシグナル伝達分子を分泌し、マトリックスの無機化を誘導し、血管は、骨の中央部分に、そして、アポトーシスの際に、骨芽細胞 (骨形成セル) が一次骨化中心^3,4を形成するマトリックスに浸潤することを可能にする。無機化されたマトリックスは、骨芽細胞がこの劣化した軟骨を骨格⁵に置き換えて移行する血管の浸透を促進する。ほとんどの骨芽細胞は、軟骨膜から軟骨基質に浸潤し、軟骨⁶を包み込む繊維層である。あるいは、肥厚性軟骨細胞の割合は、骨芽細胞^7、8、9に生存し、transdifferentiate することができます。骨の最終的な長さは、一時的な軟骨の蓄積された成長によるものであり、その成長速度は、肥大性軟骨細胞の数およびサイズ、およびそれらのマトリックス産生¹⁰に依存する。さらに、最後の肥大期の持続時間が骨¹¹の最終的な長さと相関することが最近示された。したがって、これらの細胞の増殖および分化の厳密な調節は、正しい骨サイズを確保するために必要である。

組織や成長プレートの開発に長年にわたって得られたかなりの知識にもかかわらず、これらの結論のほとんどは、固定組織学的セクションの観察に基づいています。ティッシュの区分はこのプロセスに関する貴重な情報を提供するが、技術的なアーティファクトと乗ることができる従って異なった段階間の形態的なかサイズの変更を推定するのに常に確実に使用することができない。さらに、骨の成長は動的なプロセスであるため、静的二次元 (2D) 画像は成長板の細胞の動きに限られた洞察を与え、生きた組織に対するタイムラプス撮影は、その行動に関する貴重な情報を提供することができます。成長プレート内の軟骨細胞。

これらすべての制限は、ex vivo の骨培養を使用して潜在的に解決することができます。骨培養プロトコルは、いくつかの時間前に開発されているが、彼らは限定マウスの長い骨に適用されました。研究のほとんどは、ひよこモデル^12,13によって提供される技術的な利点のためにひよこの骨を使用しています。Organotypic 培養物 (空気/液体界面) を、10日間¹⁴の培養で維持したひよこ胚大腿骨に適用した。マウスで利用可能な洗練された遺伝学的ツールは、このモデルは、ex vivo の骨の培養で使用されることが非常に魅力的にする。骨の成長を調べるためにマウスを使用した研究は、ほとんど中足骨¹⁵で働いていましたが、おそらくその小さなサイズと胚¹⁶あたりのより大きな数に起因します。伝統的に長い骨と考えられていたが、metatarsi は、インビボで他の長骨よりも早く (成長プレート¹⁷の増殖および退縮を減少させることを特徴とする) 老化を入力し、したがってそれらの連続的な増殖は実際に in vivo プロセスを不在ます。この記事の目的のために、近位および中間肢領域からの骨のための長い骨という用語を使用します。以前のいくつかの研究では、脛骨のような長いネズミ骨を、ex vivo 培養で使用し、軟骨の実質的な成長を観察したが、少し骨化¹⁸.我々はまた、最近、主に軟骨ダイナミクス¹⁹を研究するために脛骨培養物を使用しました。他の研究は、若年マウス²⁰または培養物²¹のための大腿骨の遠位部分のみから大腿骨頭を使用した。いくつかのより最近の作品では、正常な骨の ex 培養とタイムラプス撮影を組み合わせることで、生きているマウス組織^22,23における軟骨細胞の三次元 (3d) 映画を得ることができます。著者らは、骨 ex インビボ培養の潜在的適用の良い例において、増殖性ゾーン²³への軟骨細胞の再配置において以前気付かれなかった事象を観察することを管理した。静的な画像を分析する代替手段として、間接的で複雑になる手法が必要です。これは、軟骨成長のための横断的指向クローンの重要性を評価する最近の研究によって例示された、数学的モデリングと結合した多色レポーターマウス系統を用いた遺伝的トレースは²⁴を使用した。したがって、ex vivo カルチャは、動的なプロセスについてより迅速かつ簡単に洞察を得るのに役立つ可能性があります。

ここでは、マウス長骨培養のための方法を提示し、これを異なる分子処理および/またはタイムラプスライブイメージングと組み合わせることができる。このプロトコルは、以前のレポート^15、18、25で使用される方法を適応するが、いくつかの追加の問題に対処し、中足の骨ではなく、脛骨などの長骨に焦点を当てています。最後に、異なる物質の存在下で左右の骨を別々に培養することによって、統計的に強力な対比較を使用する可能性を探ります。