Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde¹. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de²adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement^3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font obstacle à la recherche d’antiviraux ou vaccins malgré des efforts considérables actuels. La quantification de la multiplication de RSV in vitro est généralement fondée sur des méthodes laborieux, longues et coûteux, qui consistent principalement en l’analyse de l’effet cytopathogène par microscopie, immunomarquage, réduction de la plaque essais, quantitatives la transcriptase inverse (EIR)-réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les immuno-essais de dosage. Virus avec des génomes modifiés et exprimant des gènes rapporteurs, comme ceux codant pour la GFP, sont plus adaptés pour ces projections. Couplé à l’usage des lecteurs de plaques automatisé, virus recombinants porteurs de gène de journaliste peuvent faire ces dosages plus adapté à la normalisation et haut débit.

Le VRS est un virus à ARN sens négatif enveloppé, un qui appartient au genre Orthopneumovirus de la Pneumoviridae famille, ordre Mononegavirales⁵. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko, qui contient une région non codante aux extrémités 3′ et 5′ appelé Leader et remorque et 10 unités de transcriptionnelles codant des 11 protéines. Les gènes sont classés comme suit : 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codant pour des protéines M2-1 et M2-2) et L-5′. L’ARN génomique est étroitement conditionné par la nucléoprotéine N. Using l’ARN génomique encapsidés comme gabarit, virale ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) assurera la transcription et la réplication de l’ARN viral. RdRp virale est composé de la protéine grande L qui porte l’activité polymérase de nucléotide en soi, son cofacteur obligatoire la phosphoprotéine de P et la protéine M2-1 qui fonctionne comme une transcription virale facteur⁶. Dans les cellules infectées, RSV induit la formation d’inclusions cytoplasmiques appelées inclusions (IBs). Les inclusions cytoplasmiques morphologiquement semblables ont été observées pour plusieurs Mononegavirales^7,8,9,10. Études récentes sur le virus rabique, virus de la stomatite vésiculaire (VSV), virus Ebola et RSV a montré que la synthèse de l’ARN virale s’effectue en IBs, qui peuvent ainsi être considérés comme usines virales^{8,9,11, 12}. les usines de virus concentré l’ARN et des protéines virales requis pour la synthèse de l’ARN virale et contiennent également des protéines cellulaires^{13,14,15,16, 17}. IBs présentent un plus fonctionnel appelé IB associées aux granules (IBAGs), qui concentrent la nouvellement synthétisée ARNm viral naissant ainsi que de la protéine M2-1. L’ARN génomique et le L, P et N ne sont pas détectés dans IBAGs. IBAGs sont de petites structures sphériques dynamiques à l’intérieur de l’ISB qui présentent les propriétés des organites liquide¹². Malgré le rôle central de l’IBs dans la multiplication virale, on sait peu sur la nature, structure interne, formation et exploitation de ces usines virales.

L’expression du génome d’un poliovirus chez un ADNc a permis la production du premier clone virale infectieuse en 1981,¹⁸. Pour négatifs virus à ARN simple brin, ce n’est qu’en 1994 que la production d’un premier virus de la rage après transfection des plasmides dans les cellules¹⁹ a eu lieu. La première axée sur le plasmide inverse système génétique pour RSV a été publié en 1995,²⁰. Génétique inverse ont conduit à des avancées majeures dans le domaine de la virologie. La possibilité d’introduire des modifications spécifiques dans le génome viral a fourni un aperçu critique de la réplication et la pathogenèse des virus à ARN. Cette technologie a également grandement facilité le développement de vaccins en permettant atténuation spécifique ciblés série de modifications. Modifications du génome qui permet un dosage rapide de multiplication virale grandement amélioré le contrôle antiviral et étude de leur mode d’action.

Bien que décrite précédemment, obtention d’organismes génétiquement modifiés RSVs reste délicate. Ici, nous détaillons un protocole pour créer deux types de recombinaison HRSV, exprimant respectivement RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Dans ce protocole, nous décrivons les conditions de transfection nécessaires pour secourir les nouveaux virus recombinants, ainsi que leur amplification afin d’obtenir des stocks viraux avec un titre élevé, adapté aux expérimentations reproductibles. La construction des vecteurs de la génétique inverse en soi n’est pas décrit ici. Nous décrivent les méthodes de récolte optimale et gel des stocks viraux. La méthode la plus précise pour mesurer les particules infectieuses virales reste essai de plaque. Cellules sont infectées par des dilutions successives de la suspension analysée et incubées avec une surcouche qui interdit la diffusion de particules virales libres dans le surnageant. Dans de telles conditions, le virus infectera seulement des cellules contiguës formant une « plaque » pour chaque particule infectieuse initial. Dans l’essai de titrage de RSV classique, les plaques sont révélés par immunomarquage et comptés sous observation microscopique. Cette méthode est coûteuse et fastidieuse. Ici, nous avons décrit un protocole très simple pour un essai de plaque RSV à l’aide de superposition de cellulose microcristalline qui permet la formation de plaques visibles à le œil nu. Nous montrons comment RSV-GFP permet de mesure RSV réplication et, partant, de quantifier l’impact des antiviraux. La combinaison génétique inverse et technologie de l’imagerie live, nous démontrons comment RSV-M2-1-GFP permet aux chercheurs de visualiser M2-1 dans des cellules vivantes et de suivre la dynamique des structures virales intracellulaires, comme IBs.