Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Menselijke RSV is de belangrijkste oorzaak van hospitalisatie voor acute respiratoire landstreekbesmetting in zuigelingen wereldwijd¹. RSV is bovendien gekoppeld aan een aanzienlijke ziektelast in volwassenen vergelijkbaar met influenza, met de meeste van de hospitalisatie en sterfte last in de oudere². Er zijn geen vaccins of specifieke antivirale middelen beschikbaar nog tegen RSV, maar veelbelovende nieuwe drugs zijn in ontwikkeling^3,4. De complexiteit en de zwaarte van de technieken van kwantificering van RSV vermenigvuldiging belemmeren de zoekt antivirale middelen of vaccins ondanks huidige aanzienlijke inspanningen. De kwantificering van RSV vermenigvuldiging in vitro is over het algemeen gebaseerd op omslachtige, tijdrovende en dure methoden, die meestal in de analyse van de cytopathogeen effect door microscopie, immunokleuring, vermindering van de plaque testen, kwantitatieve bestaat reverse-transcriptase (qRT)-de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assay proeven. Virussen met gemodificeerde genoom en het uiten van reporter genen, zoals codering voor de GFP, zijn meer geschikt voor dergelijke vertoningen. Gekoppeld aan het gebruik van geautomatiseerde plaat lezers, kunnen reporter gene-uitvoering recombinante virussen maken deze testen meer geschikt voor normalisatie en hoog-productie doeleinden.

RSV is een omhuld, nonsegmented negatief-sense RNA-virus dat tot het geslacht van de Orthopneumovirus van de Pneumoviridae familie, orde Mononegavirales^{5 behoort}. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb, waarin een noncoding regio op de 3′ en 5′ extremiteiten leider en Trailer en 10 transcriptionele eenheden codering 11 eiwitten. De genen worden als volgt gerangschikt: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codering voor M2-1 en M2-2 eiwitten) en L-5′. De genomische RNA is strak verpakt door de nucleoproteïne N. Using encapsidated genomic RNA als een sjabloon, virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) zal zorgen voor transcriptie en replicatie van de virale RNA. Virale RdRp bestaat uit het grote eiwit L die per se de polymeraseactiviteit nucleotide draagt, zijn verplichte cofactor de phosphoprotein P en de M2-1 proteïne die als een virale transcriptie functioneert factor⁶. In de geïnfecteerde cellen induceert RSV de vorming van cytoplasmatische insluitingen opneming instanties (IBs) genaamd. Morfologisch soortgelijke cytoplasmatische insluitingen zijn waargenomen voor diverse Mononegavirales^7,8,9,10. Recente studies over rabiësvirus, vesiculaire stomatitis virus (VSV), Ebola-virus en RSV bleek dat virale RNA-synthese treedt op in IBs, dat kunnen dus worden beschouwd als virale fabrieken^{8,9,11, 12}. de virus fabrieken concentreren de RNA en virale eiwitten nodig is voor virale RNA-synthese en bevatten ook cellulaire eiwitten^{13,14,15,16, 17}. IBs vertonen een functionele subcompartment genaamd IB-geassocieerde korrels (IBAGs), die zich concentreren het nieuw synthetized ontluikende virale mRNA samen met de M2-1 proteïne. De genomische RNA en de L, P en N worden niet gedetecteerd in IBAGs. IBAGs zijn kleine dynamische bolvormige structuren binnen IBs die de eigenschappen van vloeibare organellen¹²vertonen. Ondanks de centrale rol van IBs in virale vermenigvuldiging, is zeer weinig bekend over de aard, de interne structuur, de vorming en de werking van deze virale fabrieken.

De expressie van het genoom van een poliovirus uit een cDNA ingeschakeld de productie van de eerste besmettelijke virale kloon in 1981¹⁸. Voor single-stranded negatieve RNA virussen was het niet tot 1994 dat de productie van een eerste rabiësvirus na transfectie van plasmiden in cellen¹⁹ plaatsvond. Het eerste plasmide gebaseerde omgekeerde genetische systeem voor RSV werd gepubliceerd in 1995²⁰. Omgekeerde genetica hebben geleid tot belangrijke ontwikkelingen op het gebied van virologie. Kritisch inzicht in de replicatie en pathogenese van RNA-virussen heeft voorzien in de mogelijkheid van de invoering van specifieke wijzigingen in het virale genoom. Deze technologie heeft de ontwikkeling van vaccins ook aanzienlijk vergemakkelijkt doordat specifieke demping door middel van gerichte reeks wijzigingen. Genoom wijzigingen waardoor een snelle kwantificering van virale vermenigvuldiging sterk verbeterd de antivirale screening en de studie van hun werkingsmechanisme.

Hoewel eerder beschreven, blijft verkrijgen van genetisch gemodificeerde RSVs gevoelig. Hier, detail we een protocol bij het maken van twee soorten recombinante HRSV, respectievelijk uiting van RSV-GFP of RSV-M2-1-GFP. In dit protocol beschrijven we de voorwaarden van de transfectie moest redden de nieuwe recombinante virussen, evenals hun versterking te verkrijgen van virale voorraden met hoge titer, geschikt voor reproduceerbare experimenten. De bouw van het reverse genetics vectoren wordt per se hier niet beschreven. We worden methoden beschreven voor de optimale oogsten en invriezen van virale voorraden. De meest nauwkeurige methode te kwantificeren virale besmettelijke deeltjes blijft plaque assay. Cellen zijn besmet met seriële verdunningen van de geanalyseerde schorsing en geïncubeerd met een overlay die de verspreiding van gratis virale deeltjes in het supernatant verbiedt. In dergelijke omstandigheden, zal het virus alleen aangrenzende cellen vormen een “plaque” voor elk initiële infectieuze deeltje infecteren. In de conventionele RSV titratie assay, zijn plaques geopenbaard door immunokleuring en geteld onder microscopische observatie. Deze methode is duurder en tijdrovender. We beschreven hier een heel simpel protocol voor een RSV plaque assay met microkristallijne cellulose overlay waarmee de vorming van plaques zichtbaar met het blote oog. We laten zien hoe RSV-GFP kan worden gebruikt op maatregel RSV replicatie en, dus, op het kwantificeren van de impact van antivirale middelen. Omgekeerde genetica en levende imaging technologie te combineren, we laten zien hoe de RSV-M2-1-GFP wetenschappers te visualiseren M2-1 in levende cellen en volgen de dynamiek van intracellulaire virale structuren, zoals IBs toestaat.