重组呼吸道合胞病毒的生成、扩增和滴定

人 RSV 是全世界婴儿急性呼吸道感染住院的主要原因¹。此外, RSV 与成人的疾病负担相当, 与流感相当, 老年人的住院和死亡负担^大多为2。目前还没有针对 rsv 的疫苗或特定的抗病毒药物, 但有希望的新药正在开发^{中 3,4}。RSV 乘法定量技术的复杂性和繁重程度阻碍了寻找抗病毒药物或疫苗的工作, 尽管目前作出了相当大的努力。RSV 体外增殖的定量一般是基于费力、耗时、昂贵的方法, 主要是通过显微镜、免疫染色、斑块还原量、定量等方法对细胞病理效应进行分析。逆转录酶 (qRT)-聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验。具有修饰基因组和表示记者基因的病毒, 如 GFP 编码的病毒, 更适合于此类筛选。结合自动化平板阅读器的使用, 记者基因携带重组病毒可以使这些检测更适合标准化和高通量的目的。

RSV 是一种包覆的、非分段的负感 RNA 病毒, 属于肺炎家族的正交肺炎病毒属, 顺序mononegavirales5。RSV 基因组是一种单链、负感 RNA, 约为 15 kb, 它包含一个位于 3 ‘ 和 5 ‘ 末端的非编码区域, 称为 “引线” 和 “预告片”, 以及10个编码11蛋白的转录单元。基因顺序如下: 3 ‘-NS1、NS2、N、p、M、SH、g、f、M2 (m2-1 和 M2-2 蛋白编码) 和 L-5 ‘。基因组 RNA 由核蛋白 N 紧密包装, 以包塞化基因组 RNA 为模板, 病毒 rna 相关 RNA 聚合酶 (RdRp) 将确保病毒 RNA 的转录和复制。病毒 Rrp 由携带核苷酸聚合酶活性的大蛋白 L、其强制性辅因子磷蛋白 P 和作为病毒转录因子⁶的 m2-1 蛋白组成。在受感染的细胞中, RSV 诱导细胞质体内含物的形成, 称为包涵体 (IBs)。在几个mononegavirales7^{,8, 9},¹⁰中观察到了类似的形态类似的细胞质内含物。最近关于狂犬病毒、泡状口炎病毒 (vsv)、埃博拉病毒和 rsv 的研究表明, 病毒 rna 合成发生在 ibs 中, 因此可以被视为病毒工厂^8,9,^11,12. 病毒工厂集中了病毒 rna 合成所需的 rna 和病毒蛋白, 还含有细胞蛋白 13^{、14、15、16、17}. ibs 表现出一个称为 IB-associated 颗粒 (iba) 的功能亚隔间, 该亚隔间集中了新合成的新生病毒 mrna 以及 mRNA 蛋白。在 Ibag 中没有检测到基因组 Rna 和 L、P 和 N。Ibag 是 IBs 内部的小动态球状结构, 表现为液体细胞器¹²的性质。尽管 IBs 在病毒增殖中发挥着核心作用, 但对这些病毒工厂的性质、内部结构、形成和运营了解甚少。

来自 cDNA 的脊髓灰质炎病毒基因组的表达使 1981年18年首次感染病毒克隆得以产生.对于单链阴性 RNA 病毒, 直到1994年才产生第一种狂犬病病毒, 然后将质粒转染成细胞¹⁹ 。1995年20年公布了第一个基于血浆的 rsv 反向遗传系统.反向遗传学在病毒学领域取得了重大进展。在病毒基因组中引入特定修饰的可能性为 RNA 病毒的复制和发病机制提供了重要的见解。这项技术还通过有针对性的一系列修改, 使疫苗的开发能够产生具体的衰减。基因组修饰允许快速定量的病毒增殖大大改善了抗病毒筛选和研究其作用模式。

虽然前面描述过, 但获得转基因 Rsv 仍然很微妙。在这里, 我们详细介绍了一种创建两种类型的重组 HRSV 的协议, 分别表示 RSV-GFP 或 RSV-M1-GFP。在该协议中, 我们描述了抢救新的重组病毒所需的转染条件, 以及它们的扩增, 以获得高滴度的病毒库存, 适合可重复的实验。这里没有描述反向遗传学载体本身的构造。我们确实描述了最佳收集和冷冻病毒种群的方法。量化病毒感染颗粒最准确的方法仍然是斑块检测。细胞感染了连续稀释的分析悬浮液和孵育覆盖, 禁止扩散自由病毒颗粒在上清液。在这种情况下, 病毒只会感染连续的细胞, 形成每个初始传染性颗粒的 “斑块”。在传统的 RSV 滴定法中, 斑块通过免疫染色结果, 并在显微观察下计数。这种方法既昂贵又耗时。在这里, 我们描述了一个非常简单的协议 RSV 斑块检测使用微晶纤维素覆盖, 使斑块的形成可见肉眼。我们展示了如何使用 RSV-GFP 来测量 RSV 复制, 从而量化抗病毒药物的影响。结合反向遗传学和活体成像技术, 我们展示了 RSV-M1-GFP 如何允许科学家在活细胞中想象 M2-1, 并跟踪细胞内病毒结构的动态, 如 IBs。