Summary

클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

Published: February 15, 2019
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Summary

이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.

Abstract

Stomatal 운동 중재 공장 가스 교환, 광합성과 증발을 위해 필수적 이다. Stomatal 열고 닫는 중요 한 증가 의해 달성 되 고 각각 가드 셀 볼륨 감소. 때문에 이온과 물의 셔틀 수송 가드 셀과 큰 이웃 상피 세포 간의 stomatal 운동 하는 동안, 식물 stomata의 간격된 분포 stomatal 움직임을 위해 최적의 배포를 간주 됩니다. Stomata의 간격된 패턴 perturbing에 대 한 실험 시스템은 간격 패턴의 의미를 검사 하는 데 유용 합니다. 간격된 stomatal 배포와 관련 된 몇 가지 핵심 유전자 확인 되었습니다, 그리고 클러스터 stomata를 실험적으로이 유전자를 변경 하 여 유도 될 수 있다. 또는 클러스터 stomata 또한 유전 수정 없이 exogenous 치료에 의해 유도 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 클러스터 stomata 애기 thaliana 묘 목에 대 한 간단한 유도 시스템을 설명합니다. 우리의 방법은 간단 하 고 유전자 변형 또는 돌연변이 라인에 직접 적용 합니다. 더 큰 엽록체 자당 유도 된 클러스터 가드 셀의 셀 생물 학적 특징으로 표시 됩니다. 또한, 대뇌 피 질의 microtubules의 대표적인 confocal 현미경 이미지 클러스터 된 가드 세포의 세포내 관찰의 예제로 표시 됩니다. 대뇌 피 질의 microtubules의 레이디얼 방향 간격된 가드 셀 제어 조건에서와 같이 클러스터 된 가드 셀에 유지 됩니다.

Introduction

공장 stoma는 광합성과 증발, 가스 교환에 대 한 필수적인 기관 이다 그리고 stomatal 운동 이온 기반 통풍 관 및 물의 출시를 통해 감시 세포에 중요 한 변화에 의해 수행 됩니다. 현미경, 우리는 나뭇잎과 줄기의 표면에는 stomata의 간격된 분포 패턴을 관찰할 수 있다. Stomata의이 간격된 분포 stomatal 운동, 가드 셀과 표 피 세포1,2이웃 간의 이온 그리고 물 교류에 의해 규제 됩니다 있도록 간주 됩니다. 클러스터 된 stomata에 대 한 실험 유도 시스템은 stomata의 간격된 분포의 중요성을 조사 하는 데 유용 합니다.

그것은 그 stomata의 공간 클러스터링 유도 될 수 있다 감시 세포 감 별 법3,4 또는5화학 복합 치료에 대 한 핵심 유전자의 유전 수정에 의해 보고 되었습니다. 우리는 또한 중간 솔루션으로 집중 치료 설탕 자당, 포도 당를 포함 하 여 보충 및과 당 발생 stomatal 클러스터링 cotyledons 애기 thaliana6의에서 보고 했다. 자당 솔루션 집중 치료는 누설을 방지 하는 세포 벽을 부정적인 영향을 제안 자당 취급 떡 표 피에서 감소 callose meristemoids와 표 피 세포를 분리 하는 새로운 세포 벽에 관찰 하 고 표 피 인접으로 가드 세포 분화 (예: 녹음 방송 요인)에 대 한 주요 유전자 제품의 소성 행동6세포. 비슷한 메커니즘은 gsl8/쵸 돌연변이7,8에 대 한 연구에서 제안 했다. 자당 포함 된 중간 솔루션을 사용 하 여 클러스터 된 stomata의 재현 유도 대 한 우리의 실험 시스템은 매우 간단 하 고 저렴 한. 그것은 또한 세포 및 표현 형광 마커 그 레이블 세포내 구조9, 유전자 변형 라인에 적용 될 때 클러스터 된 가드 셀에 골격 같은 세포내 구조를 조사 하 사용할 수 있습니다. 10.

Protocol

1. 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 준비 비 커에 1.1 g 重 Skoog 중간 소금의 고 자당의 15 g을 추가 합니다. 490 mL 증류수를 추가 하 고 잘 저 어 막대를 사용 하 여 혼합. 코를 사용 하 여 5.8에 pH를 조정 합니다. 500 mL 증류수와 묽 게 하십시오 그리고 중간 병으로 솔루션을 전송. 압력가 마로 소독 (121 ° C, 20 분) 하 여 솔루션을 소독. 즉시 사용 하지이 솔루션…

Representative Results

여기, A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션 stomatal 클러스터링 유도의 간단한 방법에 대 한 프로토콜 제시 하고있다. 자당 포함 된 중간 솔루션 (그림 1B) 성장 클러스터 된 가드 셀 가드 셀 자당 무료 제어 조건 (그림 1A)에서 성장 보다 더 큰 엽록체 있다. 엽록체의 확대와 CT GFP11</s…

Discussion

우리는 제시한 클러스터 stomata의 유도 대 한 프로토콜 A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료. 다음과 같이,이 방법은 매우 간단 하 고 없는 전문된 기술이 필요로 하지만 효율적으로 클러스터 stomata를 일으킬 수 있다. 가드 셀의 45% 이상 3% 자당 포함 된 클러스터는 중간 솔루션 (20 개 이상의 독립적인 관측의 평균 값)6. 또한,이 실험 시스템 적용할 수 있는 ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 우리의 일의 그의 종류 지원을 위한 교수 Seiichiro Hasezawa에 감사입니다. 이 작품은 과학 진흥 (JSP) KAKENHgrant 숫자 17 K 19380 18 H 05492, 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 보조금은 스미 토모 재단에서 부여 번호 160146, 및 캐논 재단 남에 대 한 일본 사회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 이 실험적인 시스템 K. a JSP KAKENHgrant 번호 26891006에서에서 재정 지원 아래 개발 되었다 우리는 로비 루이스, MSc, 원고의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 감사 합니다.

Materials

24-well plate Sumitomo Bakelite MS-0824R
488 nm laser Furukawa Denko HPU-50101-PFS2
488 nm laser Olympus Sapphire488-20/O
510 nm long-pass filter Olympus BA510IF
524 – 546 nm band-pass filter Semrock FF01-535/22-25
530 nm short-pass filter Olympus BA530RIF
561 nm laser CVI Melles Griot 85-YCA-025-040
604 – 644 nm band-pass filter Semrock FF01-624/40-25
Confocal laser scanning head Yokogawa CSU10
Confocal laser scanning head Olympus FV300
Cooled CCD camera Photometrics CoolSNAP HQ2
Image acquisition software Molecular Devices MetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition software Olympus FLUOVIEW v5.0
Immersion oil Olympus Immersion Oil Type-F ne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscope Olympus IX-70
Inverted microscope Olympus IX-71
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 392-00591 Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens  Olympus UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 NA = 1.35
Objective lens  Olympus UPlanAPO 40x / 0.85 NA NA = 0.85
Sucrose FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 196-00015

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Akita, K., Higaki, T. An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings. J. Vis. Exp. (144), e58951, doi:10.3791/58951 (2019).

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