シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム
Summary
このプロトコルの目的は葉緑体などの細胞内構造の観察の方法と糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼植物の子葉におけるクラスター化された気孔を誘導する方法を示します、共焦点を使用してクラスター化されたガード細胞における微小管レーザー顕微鏡。
Abstract
気孔は光合成と蒸散のために不可欠である植物のガス交換を仲介します。気孔の開閉が大きく増加して行うし、それぞれガード細胞容積の減少します。イオンと水のシャトル輸送は気孔の中に細胞とより大きい隣接する表皮細胞の間発生するため気孔の間隔の分布は気孔の最適な配分と見なされます。気孔の間隔のパターンの摂動のための実験システムは間隔パターンの重要性を確認に便利です。間隔をあけられた気孔分布に関連付けられているいくつかの重要な遺伝子が同定されている、クラスター化された気孔を実験的これらの遺伝子を変えることによって誘起することができます。また、遺伝子組み換えなしの外因性の治療によってもクラスター化された気孔を誘起することができます。この記事でショ糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼苗におけるクラスター化の気孔の単純な誘導システムについて述べる。本手法は簡単 transgenic または突然変異体の線には直接適用です。大きな葉緑体はショ糖によるクラスター化された細胞の細胞生物学的特徴として掲載されています。さらに、クラスター化された細胞の細胞内の観察の例として表層微小管の代表的な共焦点顕微鏡画像が表示されます。制御条件に間隔をあけられた細胞のようにクラスター化された細胞の表層微小管の半径方向の向きは維持されます。
Introduction
植物の気孔は光合成と蒸散、ガス交換のための不可欠な臓器とガード細胞イオン駆動型吸収と水のリリースで大幅に変更された気孔を達成しました。顕微鏡で葉や茎の表面に気孔の間隔分布を観察できます。この間隔をあけられた気孔分布細胞と隣接する表皮細胞1,2間イオンと水の交換によって調節される気孔のためと見なされます。クラスター化された気孔の実験的誘導システム、間隔をあけられた気孔分布の重要性を調査するため便利です。
それは、キー遺伝子細胞分化3,4や5化学化合物の治療のための遺伝子改変によって気孔の空間クラスター化を誘起することが報告されています。我々 はまた、ショ糖、ブドウ糖などの糖を添加した培地溶液で浸漬処理し、果糖は、シロイヌナズナ実生6の子葉における気孔クラスタ リングを引き起こしたことを報告しました。新しい細胞壁 meristemoids と表皮細胞の分離の減少カロースがショ糖溶浸漬処理が悪影響を及ぼす漏洩を防ぐ細胞壁に影響を与えることを示唆して、子葉のスクロース処理表皮で観察されたと異所性アクション ガード細胞分化 (転写因子など) に向かって隣接する主要遺伝子産物の表皮細胞の6。同様の機構は、 gsl8/チョー変異体7,8の研究から示唆されました。ショ糖含有培地溶液を使用してクラスター化された気孔の再現可能な誘導のための実験システムは非常に簡単で安いです。クラスター化されたガード細胞そのラベル細胞内構造を9,蛍光マーカーを表現するトランスジェニックは行に適用されるときの細胞骨格細胞小器官などの細胞内の構造を調査するも使用できます。10。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショ糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼苗におけるクラスター化された気孔の誘導のためのプロトコルを提案しました。下図のように、このメソッドは非常に簡単と専門的なスキルを必要としないが効率的にクラスター化された気孔を引き起こすことができます。3% スクロース含有細胞の 45% 以上が集まってメディア ソリューション (20 以上の独立した観測の平均値)<sup…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
教授誠一郎 Hasezawa を我々 の仕事の彼の親切なサポートに感謝しております。この作品は日本協会からの補助金によって支えられた科学振興 (JSPS) KAKENHgrant 番号 17 K 19380 と 18 H 05492、住友財団基礎科学研究助成「許可番号 160146、とキヤノン財団 t. h.日本学術振興会 KAKENHgrant 数 26891006 から k. a. の支援の下でこの実験システムを開発ロビー ・ ルイス、エダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) の原稿の下書きを編集してから、MSc に感謝いたします。
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Referenzen
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
