拟南芥幼苗糖溶液浸入治疗的聚集性植物诱导系统
Summary
本方案的目的是论证如何通过含糖培养基溶液浸泡处理诱导拟南芥幼苗子叶聚集气孔, 以及如何观察叶绿体等细胞内结构和微管在聚集保护细胞使用共聚焦激光显微镜。
Abstract
气孔运动介导植物气体交换, 这是光合作用和蒸腾作用所必需的。气孔开口和关闭分别是通过保护细胞体积的显著增加和减少来完成的。由于在气孔运动过程中, 离子和水的穿梭迁移发生在保护细胞和较大的相邻表皮细胞之间, 因此植物气孔的间隔分布被认为是气孔运动的最佳分布。改变气孔间距图案的实验系统有助于检验气孔间距图案的意义。几个关键基因与间隔气孔分布已被确定, 聚集气孔可以通过改变这些基因实验诱导。另外, 外源性处理也可以诱导聚集气孔, 而不进行基因改造。本文介绍了一种简单的拟南芥幼苗聚集气孔的诱导系统, 该系统采用含蔗糖介质溶液浸没处理。我们的方法简单, 直接适用于转基因或突变线。较大的叶绿体被认为是蔗糖诱导的聚集保护细胞的细胞生物学特征。此外, 皮质微管的一个具有代表性的共聚焦显微图像显示为聚集保护细胞的细胞内观察的一个例子。在控制条件下, 在聚集保护细胞中保持皮质微管的径向方向, 就像在间隔的保护细胞中一样。
Introduction
植物气孔是光合作用和蒸腾作用气体交换的重要器官, 气孔运动是通过离子驱动的吸水和释放来实现的。在显微镜下, 我们可以观察到在叶片和茎的表面上气孔的间隔分布模式。气孔的这种间隔分布被认为有助于气孔运动, 这是由离子和水交换之间的保护细胞和邻近的表皮细胞1,2。聚集气孔的实验诱导系统可用于研究气孔间隔分布的重要性。
据报道, 保护细胞分化 3、4或使用化合物5处理的关键基因的基因修饰可以诱导气孔的空间聚集.我们还报告说, 浸泡治疗与中等溶液补充糖, 包括蔗糖, 葡萄糖, 果糖引起气孔聚集在拟南芥幼苗的子叶 6.在蔗糖处理的子叶表皮中观察到分离子列表和表皮细胞的新细胞壁中的钙质减少, 这表明蔗糖溶液浸泡治疗对细胞壁有负面影响, 从而防止了细胞壁的泄漏, 并防止了细胞壁的渗漏。保护细胞分化 (如转录因子) 对邻近表皮细胞的关键基因产物的异位作用6。通过对gsl8/突变体7、8的研究, 提出了类似的机制。我们的利用含蔗糖介质溶液对聚集气孔进行重复诱导的实验系统是一种相当简单、廉价的实验系统。它也可以用来研究细胞内的结构, 如细胞器和细胞骨架聚集保护细胞时, 应用于转基因线表达荧光标记, 标签细胞内结构9,10个。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提出了用含蔗糖介质溶液浸没处理诱导刺五幼苗聚集气孔的方案。如图所示, 这种方法是非常简单的, 不需要专门的技能, 但可以有效地诱导聚集气孔。超过45% 的保护细胞聚集在3% 含蔗糖的介质溶液中 (平均值超过20个独立观察)6。此外, 该实验系统可直接应用于转基因或突变线, 如表达 ct-gfp (图 1) 或 gfp-tub6 (图 2) 所示。虽然?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢长泽一郎教授对我们工作的善意支持。这项工作得到了日本科学促进会 kakenh给定 17 kh给定和18H05492 的赠款、住友基金会为基础科学研究项目赠款提供的第160.146 笔赠款和佳能基金会向 t. h. h. 提供的赠款。这一实验系统是在 jps kakenh给定号26891006至 k. a. 的财政支持下开发的。我们感谢来自 edanz group (www.edanzediting.com/ac) 的 r比robis, msc 编辑了手稿草稿。
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
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