Summary

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Published: May 04, 2018
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Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Abstract

Trans-Plasma Membran Elektronentransport (tPMET) spielt eine Rolle im Schutz der Zellen vor intrazellulären reduktiven Stress sowie Schutz vor Schäden durch extrazelluläre Oxidantien. Dieser Prozess für den Transport von Elektronen von intrazellulären Reduktionsmitteln extrazelluläre Oxidantien ist nicht gut definiert. Hier präsentieren wir Ihnen spektralphotometrische Proben von C2C12 Myotubes tPMET unter Verwendung der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren zu überwachen: wasserlösliche tetrazoliumsalz Salz-1 (WST-1) und 2,6-Dichlorophenolindophenol (‑Aufklärung oder DCIP). Durch die Reduzierung der diese Elektronen-Akzeptoren sind wir in der Lage, diesen Prozess in eine Echtzeit-Analyse zu überwachen. Mit dem Zusatz von Enzymen wie Ascorbat Oxidase (AO) und Superoxid-Dismutase (SOD) für die Tests können wir bestimmen, welcher Teil des tPMET durch Ascorbat Export oder Superoxid Produktion, bzw. ist. Während WST-1 zu stabilen Ergebnissen mit niedrigen Hintergrund gezeigt wurde, konnte ‑Aufklärung nach der Zugabe von AO und SOD, die photometrische Analyse zeigte wieder oxidiert werden. Diese Methode zeigt einen in Echtzeit, Multi-gut, schnelle photometrische Assay mit Vorteilen gegenüber anderen Methoden verwendet, um tPMET, wie ferricyanid (FeCN) und Ferricytochrome C Reduktion zu überwachen.

Introduction

Die Fähigkeit des gereinigten Plasmamembranen, Elektronen-Akzeptoren reduzieren führte zu der Ansicht, dass der Plasmamembran ein Redox-inhärente Kapazität1hat. Zuvor in Pilzen, Pflanzen und Tiere gesehen, ist tPMET ein Prozess üblich, mehrere Organismen2,3,4,5. Insbesondere wurde dabei in Saccharomyces Cerevisiae, Karotte Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Osteosarkom, Melanom, Makrophagen, Skelettmuskel und Neutrophilen2,3, nachgewiesen 4 , 5 , 6 , 7. in einem Prozess, der Elektronen über die Plasmamembran extrazelluläre Oxidantien reduzieren transportiert, tPMET engagiert sich in vielen Zellfunktionen einschließlich: Zelle Wachstum5,8, Zelle überleben9, Eisen Stoffwechsel10, Zelle11,12,13, und Schutz vor reaktiven Sauerstoff-Spezies12,14,15. Aufgrund des tPMET Engagements in vielen Zellfunktionen, Hypothese aufgestellt die ein Ungleichgewicht von tPMET als Beitrag zu der Entwicklung von einigen schweren gesundheitlichen Bedingungen, einschließlich Krebs16, Herz-Kreislauf-Krankheit17, und Stoffwechselerkrankungen Syndrom18.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Übertragung von Elektronen in der Plasmamembran zu überwachen, aber die am häufigsten verwendete Technik ist die Reduzierung der extrazellulären Elektronen Akzeptoren durch farbmetrische Assays zu beurteilen. Häufig verwendete extrazelluläre Elektronen Akzeptoren sind tetrazoliumsalz Salze, ‑Aufklärung, FeCN und Ferricytochrome C19,20. Das am häufigsten verwendete Tetrazolium-Salz ist als WST-119eine zweite Generation Salz bekannt. Diese Verbindung ist einfacher zu nutzen in farbmetrische Untersuchungen im Vergleich zur ersten Generation tetrazoliumsalz Salze durch zwei Sulfonate Gruppen, die die Wasser Löslichkeit21zu erhöhen. WST-1, wird in Verbindung mit der mittleren Elektron Akzeptor 1-Methoxy-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten), in zwei Einzel-Elektronentransfer Ereignisse reduziert. Diese Reduktion ändert die schwach gefärbte oxidierte Form von WST-1 zu einer intensiveren, gelbe Formazan20,22. WST-1 hat eine hohe molare Aussterben Koeffizient von 37 x 103 M-1cm-1, führt zu einer hohen Assay Empfindlichkeit21,22. ‑Aufklärung wird auch als eine extrazelluläre Elektron Akzeptor tPMET Überwachung genutzt. Es hat sich gezeigt, dass ‑Aufklärung tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren23,24extrazellulär gesenkt werden kann. Aufgrund des Fehlens der Mittelstufe Elektronen-Akzeptoren ‑Aufklärung können direkt Pick-up Elektronen aus der Plasmamembran, im Gegensatz zu WST-124. Ähnlich wie bei ‑Aufklärung, FeCN nachweislich extrazellulär tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren19,24, ferrocyanid gesenkt werden. Im Gegensatz zu WST-1 und ‑Aufklärung hat FeCN eine niedrige molare Aussterben Koeffizient führt zu einem geringeren Assay Empfindlichkeit9. Eine andere häufig verwendete extrazelluläre Elektron Akzeptor, tPMET zu überwachen ist Ferricytochrome c. WST-1, Ferricytochrome C Reduktion steigt mit dem Einsatz von mittleren Elektron Akzeptor, Komponenten22ähnlich. Im Gegensatz zu WST-1 ist jedoch die Ferricytochrome C Methode aufgrund hoher Hintergrund und eine niedrige molare Aussterben Koeffizient22weniger empfindlich.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Echtzeit-Analyse des tPMET durch photometrische Tests. Die Methode genutzt die extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren WST-1 und ‑Aufklärung, da sie beide einen hohen molaren Aussterben Koeffizienten haben, während weniger teuer im Vergleich zu den anderen häufig extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren wie Ferricytochrome c eingesetzt. Wir nutzten phenazinderivat Methosulfate (PMS) anstelle von Komponenten haben sie eine ähnliche chemische Zusammensetzung und PMS ist weit weniger teuer. Komponenten ist photochemisch stabilen ein wichtiges Merkmal für eine kommerzielle Kit, die eine lange Haltbarkeit. Jedoch machen wir PMS frisch für jeden Test, damit Stabilität kein Problem sein sollte. Wir präsentieren auch eine Methode zur Evaluierung möglicher enzymatischer Interaktionen (siehe Abbildung 1) zwischen der extrazellulären Elektron Akzeptor und Enzyme, die genutzt werden können, um den Prozess der tPMET weiter zu charakterisieren. Insbesondere ermitteln die Enzyme, die AO und SOD verwendet werden kann, welcher Teil des tPMET ist durch Ascorbat Transport oder extrazellulären Superoxid Version, zwei gängige Methoden für Elektronen über die Plasmamembran transportiert werden.

Protocol

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte. 1. Reduzierung der WST-1-Assay Wachsen Sie und differenzieren Sie C2C12 adhärente Zellen mit Standardzellen Kultur Verfahren7 in einer 96-Well-Platte mit Zeilen A-F. Verwenden Sie eine Differenzierung Medium aus der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 2 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergän…

Representative Results

Statistiken wurden mit ANOVA mit wiederholten Messungen mit RStudio Statistiksoftware25durchgeführt. Stichprobengrößen entnehmen Sie bitte der Abbildung Legenden. Um tPMET zu überwachen, wurden C2C12 Myotubes zusammen mit extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung eingesetzt. AO wurde verwendet, um festzustellen, welcher Teil der WST-1 und ‑Aufklärung Reduktion wurde durch Asc…

Discussion

Wir haben zwei Methoden zur Nutzung von extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung, in spektralphotometrische Untersuchungen zur Überwachung von tPMET in C2C12 Myotubes vorgestellt. Mit dem Wachstum von Zelllinien im standard Kultur Verfahren und ein Spektralphotometer Platte Leser ist es möglich, tPMET mit dieser Elektronen-Akzeptoren in einem einfachen Mikrotestplatte Assay zu überwachen. WST-1 Reduzierung ist reproduzierbar aus Brunnen, Brunnen in einen Test, aber es gibt tägliche Variabilit?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Neej Patel, Thomas Bell, Lyn Mattathil und Mark Mannino für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von United States Public Health Service Award R15DK102122 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK), Jonathan Fisher unterstützt. Der Manuskript-Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIDDK oder die National Institutes of Health.

Materials

C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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