Summary

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Published: May 04, 2018
doi:

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد سبيكتروفوتوميتريكالي البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل الاستفادة من المتقبلين للإلكترون خارج الخلية وتحليل التفاعلات الانزيمية التي قد تحدث مع هذه متقبلون الإلكترون خارج الخلية.

Abstract

البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل (تبميت) يلعب دوراً في حماية الخلايا من الإجهاد التخفيض داخل الخلايا، فضلا عن الحماية من الأضرار بالخلية للتأكسد. هذه العملية لنقل الإلكترونات من تأشيب داخل الخلية إلى خارج الخلية للتأكسد ليست محددة تحديداً جيدا. هنا نقدم فحوصات سبيكتروفوتوميتريك من ميوتوبيس C2C12 لرصد استخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية تبميت: تيترازوليوم للذوبان في الماء الملح-1 (WST-1) و 2, 6-ديتشلوروفينوليندوفينول (دبيب أو دسيب). من خلال الحد من هذه متقبلون الإلكترون، نحن قادرون على مراقبة هذه العملية في تحليل في الوقت الحقيقي. مع إضافة الإنزيمات مثل اسكوربات أوكسيديز (AO) وفائق أكسيد الفاءق (الأحمق) إلى فحوصات، يمكننا تحديد أي جزء من تبميت هو سبب إنتاج التصدير أو فائق أكسيد اسكوربات، على التوالي. بينما أبدى WST-1 تحقيق نتائج مستقرة مع خلفية منخفضة، دبيب كانت قادرة على أن تكون إعادة المؤكسد بعد إضافة AO والهيئة العامة للسدود، الذي تجلى بتحليل سبيكتروفوتوميتريك. يوضح هذا الأسلوب مقايسة سبيكتروفوتوميتريك في الوقت الحقيقي، وكذلك متعددة، سريعة مع مزايا أكثر من الأساليب الأخرى المستخدمة لرصد تبميت، مثل سيانيد (فيكن) وتخفيض فيريسيتوتشرومي ج.

Introduction

قدرة تنقية البلازما الأغشية للحد من المتقبلين للإلكترون أدى إلى ت ري أن غشاء البلازما على قدرات الكامنة الأكسدة1. رأيت سابقا في الفطريات والنباتات، والحيوانات، تبميت عملية مشتركة بين الكائنات الحية متعددة2،3،،من45. على وجه التحديد، هذه العملية قد تجلى في Saccharomyces cerevisiae، الجزرة الخلايا والكريات الحمراء، لمفاوية، osteosarcoma، وسرطان الجلد، الضامة، والهيكل العظمى والعضلات والعدلات2،3، 4 , 5 , 6 , 7-يشارك في عملية نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما لتقليل المؤكسدات خارج الخلية، تبميت في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك: الخلية النمو5،8، بقاء الخلية9، الحديد استقلاب10، الخلية إشارات11،،من1213، والحماية من الأكسجين التفاعلية الأنواع12،،من1415. بسبب المشاركة تبميت في العديد من الوظائف الخلوية، قد تم الافتراض باختلال تبميت للمساهمة في تطوير بعض الظروف الصحية الخطيرة، بما في ذلك السرطان16،17من أمراض القلب والأوعية الدموية، والتمثيل الغذائي متلازمة18.

هناك عدة طرق لمراقبة نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما، ولكن الأسلوب الأكثر استخداماً لتقييم الحد المتقبلين الإلكترون خارج الخلية عن طريق فحوصات اللونية. متقبلون الإلكترون خارج الخلية استخداماً هي أملاح تيترازوليوم ودبيب وفيكن وفيريسيتوتشرومي ج19،20. الملح tetrazolium الأكثر استخداماً معروف ملح من الجيل الثاني ك WST-119. هذا المركب أسهل لاستخدامها في فحوصات قياس الألوان مقارنة بالجيل الأول tetrazolium أملاح نتيجة الفريقين المشبعة بالفلور أوكتين، التي تزيد من القابلية للذوبان في الماء،21. WST-1، بالاشتراك مع ميثوسولفاتي فينازيني-1-ميثوكس يقبلون الإلكترون المتوسطة (مبمس)، يتم تقليل في اثنين واحد إلكترون نقل الأحداث. هذا الحد يتغير شكل WST-1 المؤكسدة ضعيفة الملون إلى20،فورمازان أكثر كثافة، والأصفر22. وقد WST-1 معامل انقراض مولى عالية 37 × 103 م-1سم-1، مما أدى إلى مقايسة عالية حساسية21،22. دبيب كما يستخدم يقبلون إلكترون خارج الخلية لمراقبة تبميت. فقد ثبت أنه يمكن تخفيض دبيب اكستراسيلولارلي من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون23،24. بسبب انعدام متقبلون إلكترون الوسيطة، دبيب يمكن مباشرة الإلكترونات البيك آب من غشاء البلازما، وعلى عكس WST-124. مشابهة دبيب، ثبت فيكن أن تقلص اكستراسيلولارلي إلى فيروسيانيد من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون19،24. على عكس WST-1 ودبيب، قد فيكن معامل انقراض مولى منخفضة مما يؤدي إلى حساسية فحص السفلي9. آخر يقبلون الإلكترون خارج الخلية المستخدمة عادة لرصد تبميت هو فيريسيتوتشرومي جيم على غرار WST-1، فيريسيتوتشرومي ج الحد من الزيادات باستخدام يقبلون الإلكترون المتوسطة، مبمس22. رغم ذلك، خلافا WST-1 الأسلوب ج فيريسيتوتشرومي أقل حساسية بسبب خلفية عالية ومعامل انقراض مولى منخفضا22.

هنا نقدم طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي من تبميت عن طريق فحوصات سبيكتروفوتوميتريك. تستخدم الأسلوب متقبلون الإلكترون خارج الخلية WST-1 ودبيب، كلا منهما لديها معامل انقراض مولى عالية رغم كونها أقل تكلفة مقارنة بأخرى يشيع استخدامها متقبلون الإلكترون خارج الخلية مثل ج فيريسيتوتشرومي. يمكننا الاستفادة من فينازيني ميثوسولفاتي (PMS) بدلاً من مبمس لديهم التركيب الكيميائي مماثلة والدورة الشهرية أقل تكلفة بكثير. مبمس الهيدروكسى مستقرة وهو سمة هامة لمجموعة تجاري يحتاج إلى حياة طويلة الجرف. بيد أننا جعل الدورة الشهرية طازجة لكل فحص، حيث الاستقرار لا ينبغي أن يكون مشكلة. ونقدم أيضا وسيلة لتقييم التفاعلات الانزيمية الممكنة (انظر الشكل 1) بين يقبلون الإلكترون خارج الخلية والأنزيمات التي يمكن استخدامها لوصف عملية تبميت كذلك. على وجه التحديد، تحديد الإنزيمات AO والهيئة العامة للسدود يمكن أن تستخدم أي جزء من تبميت بسبب النقل اسكوربات أو الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية، هما الأساليب الشائعة للإلكترونات بنقلها عبر غشاء البلازما.

Protocol

ملاحظة: انظر الشكل 1 نظرة تخطيطية للخطوات الرئيسية. 1-مقايسة الحد WST-1 تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة باستخدام الخلية القياسية الثقافة الإجراءات7 في صفيحة 96-كذلك استخدام الصفوف A-f. استخدام وسيلة تمايز تتألف من المتوسطة (دميم “تعديل…

Representative Results

إحصاءات أجريت مع ANOVA مع التدابير المتكررة باستخدام البرمجيات الإحصائية RStudio25. يتم الإشارة إلى أحجام العينات في أساطير الرقم. واستخدمت لرصد تبميت، ميوتوبيس C2C12 جنبا إلى جنب مع الإلكترون خارج الخلية المتقبلين، WST-1 ودبيب. AO واست…

Discussion

وقد قدمنا طريقتين لاستخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية، WST-1 ودبيب، في فحوصات سبيكتروفوتوميتريك لرصد تبميت في ميوتوبيس C2C12. مع نمو خطوط الخلايا في الإجراءات القياسية الثقافة وقارئ لوحة جهاز المطياف الضوئي، من الممكن رصد تبميت مع هذه متقبلون إلكترون في مقايسة ميكروسكوبية بسيطة. WST-1 الحد …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن أشكر بيل توماس، لين ماتاتهيل ومارك مانينو ونج باتل لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد هذا العمل جائزة “الخدمة الصحية العامة في الولايات المتحدة” R15DK102122 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي (NIDDK) لجوناثان فيشر. محتوى المخطوطة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية نيدك أو “المعاهد الوطنية للصحة”.

Materials

C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

Referenzen

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemie. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemie. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

View Video