Summary

Trans-Plasma Membrane Transport des électrons par les Myotubes C2C12 de mesure

Published: May 04, 2018
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Summary

Ce protocole vise à surveiller par spectrophotométrie trans-plasma membrane transport d’électrons utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire et d’analyser les interactions enzymatiques qui peuvent survenir avec ces accepteurs d’électrons extracellulaire.

Abstract

TRANS-plasma membrane transport d’électrons (tPMET) joue un rôle dans la protection des cellules du stress réductrice intracellulaire ainsi que la protection contre les dommages causés par les oxydants extracellulaires. Ce processus de transport des électrons de réducteurs intracellulaires extracellulaire oxydants n’est pas bien défini. Nous présentons des analyses spectrophotométriques de myotubes C2C12 pour surveiller tPMET utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire : tétrazolium soluble dans l’eau sel-1 WST-1 et 2, 6-dichlorophénolindophénol (DPIP ou DCIP). Grâce à la réduction de ces accepteurs d’électrons, nous sommes en mesure de contrôler ce processus dans une analyse en temps réel. Avec l’ajout d’enzymes telles que l’ascorbate oxydase (AO) et de la superoxyde dismutase (SOD) pour les essais, nous pouvons déterminer quelle partie du tPMET est due à la production de superoxyde ou de l’exportation d’ascorbate, respectivement. WST-1 a montré des résultats stables avec faible bruit de fond, DPIP a pu être ré-oxydé après l’ajout des AO et des mottes de terre, qui a été démontrée avec l’analyse spectrophotométrique. Cette méthode montre un dosage spectrophotométrique multipuit, rapide, en temps réel avec les avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour surveiller les tPMET, tels que ferricyanure (FeCN) et ferricytochrome c réduction.

Introduction

La capacité des membranes de plasma épurés de réduire les accepteurs d’électrons a conduit à l’idée que la membrane plasmique a une capacité inhérente redox1. Vu précédemment dans les champignons, les plantes et animaux, tPMET est un processus commun à plusieurs organismes2,3,4,5. Plus précisément, ce processus a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, cellules de carotte, érythrocytes, lymphocytes, ostéosarcome, mélanome, macrophages, le muscle squelettique et neutrophiles2,3, 4 , 5 , 6 , 7. dans un processus qui transporte les électrons à travers la membrane de plasma pour réduire les oxydants extracellulaires, tPMET est impliqué dans nombreuses fonctions cellulaires, y compris : cellule croissance5,8, de la viabilité cellulaire9, fer métabolisme des10,11,12,13et protection contre l’oxygène réactif espèces12,14,15de signalisation cellulaire. En raison de l’implication de tPMET dans de nombreuses fonctions cellulaires, un déséquilibre de tPMET a émis l’hypothèse pour contribuer au développement de certains troubles de santé graves, y compris le cancer16,17de maladies cardiovasculaires, métaboliques et le syndrome18.

Il y a plusieurs façons de contrôler le transfert des électrons à travers la membrane de plasma, mais la technique la plus largement utilisée est d’évaluer la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire par dosages colorimétriques. Accepteurs d’électrons extracellulaire couramment utilisés sont les sels de tétrazolium, DPIP, FeCN et ferricytochrome c19,20. Le sel de tetrazolium plus couramment utilisé est un deuxième génération connu sel comme WST-119. Ce composé est plus facile à utiliser dans les essais colorimétriques par rapport aux sels de tétrazolium de première génération en raison de deux groupes de sulfonate de perfluorooctane, qui augmentent sa solubilité de l’eau21. WST-1, en liaison avec l’intermédiaire électron accepteur 1-méthoxy-phénazine méthosulfate (mPMS), est réduite dans les événements de transfert d’électron deux. Cette réduction change la forme oxydée de faiblement couleur du WST-1 à une plus intense, jaune de formazan20,22. WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée de 37 x 103 M-1cm-1, conduisant à un dosage haute sensibilité21,22. DPIP est également utilisé comme un accepteur d’électrons extracellulaire pour surveiller tPMET. Il a été démontré que DPIP peut être réduit extracellulaire par tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs23,24. En raison de l’absence d’accepteurs d’électrons intermédiaire, DPIP peut directement électrons pick-up de la membrane plasmique, contrairement à WST-124. Semblable à DPIP, FeCN s’est avéré extracellulaire réduit à ferrocyanure de tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs19,24. Contrairement à WST-1 et DPIP, FeCN a un coefficient d’extinction molaire bas menant à un plus faible dosage sensibilité9. Un autre accepteur d’électron d’extracellulaire couramment utilisés pour surveiller les tPMET est ferricytochrome c. semblable à WST-1, ferricytochrome c réduction augmente avec l’utilisation d’accepteur d’électrons intermédiaire, mPMS22. Contrairement à WST-1, la méthode de ferricytochrome c est moins sensible en raison d’un haut fond et une extinction molaire faible coefficient22.

Nous présentons ici une méthode d’analyse en temps réel de tPMET par le biais de dosages par spectrophotométrie. La méthode utilisée les accepteurs d’électrons extracellulaire WST-1 et DPIP, car ils ont un coefficient d’extinction molaire élevée tout en étant moins cher par rapport à l’autre couramment utilisé accepteurs d’électrons extracellulaire comme ferricytochrome c. Nous avons utilisé la phénazine méthosulfate (PMS) au lieu de MPM, ils ont une composition chimique similaire et PMS est beaucoup moins cher. mPMS photochimiquement stable qui est une caractéristique importante pour une trousse commerciale qui a besoin d’une longue durée de vie. Toutefois, nous faisons PMS frais pour chaque dosage, donc stabilité ne devrait pas être un problème. Nous présentons aussi une méthode pour évaluer les possibles interactions enzymatiques (voir Figure 1) entre l’accepteur d’électron extracellulaire et des enzymes qui peuvent être utilisés afin de caractériser le processus de tPMET. Plus précisément, les enzymes AO et SOD peuvent servir déterminent quelle partie du tPMET est due à transport ascorbate ou communiqué de superoxyde extracellulaire, deux méthodes courantes pour les électrons d’être transporté à travers la membrane plasmique.

Protocol

Remarque : Voir la Figure 1 pour un aperçu schématique des étapes clés. 1. WST-1 réduction dosage Croître et se différencier C2C12 cellules adhérentes à l’aide de procédures standard cell culture7 dans une plaque à 96 puits utilisant des lignes A-F. Utiliser un moyen de différenciation composé de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 2 % de sérum de cheval, 100 U/mL de péni…

Representative Results

Statistiques ont été réalisées avec ANOVA à mesures répétées à l’aide de logiciels statistiques RStudio25. Tailles d’échantillon sont indiqués dans les légendes de la figure. Pour surveiller les tPMET, les myotubes C2C12 étaient utilisés parallèlement accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP. AO a été utilisée pour déterminer quelle partie du WST-1 réduction DPIP r?…

Discussion

Nous avons présenté deux méthodes d’utilisation d’accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP, dans des dosages spectrophotométriques pour surveiller les tPMET dans les myotubes C2C12. Avec la croissance de lignées cellulaires dans les méthodes de culture standard et d’un lecteur de spectrophotomètre, il est possible de surveiller tPMET avec ces accepteurs d’électrons dans un essai simple microplaque. WST-1 réduction est reproductible de puits à puits dans un essai, mais il existe une varia…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino et Neej Patel pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par l’award de l’United States Public Health Service R15DK102122 de l’Institut National du diabète et l’appareil digestif et la Kidney Diseases (NIDDK) à Jonathan Fisher. Le contenu du manuscrit est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NIDDK ou le National Institutes of Health.

Materials

C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Diesen Artikel zitieren
Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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