Summary

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Published: April 20, 2018
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Summary

この通信は、人間から肺胞大食細胞の分離と培養の方法論や実験用マウスのモデルについて説明します。

Abstract

肺胞マクロファージは、肺居住者、最終分化マクロファージ出生前原産です。肺胞マクロファージは、寿命が長く、肺開発機能とその肺局所応答感染症や炎症に重要な役割でユニークです。日には、識別、分離、および人間およびマウスから肺胞マクロファージの処理の統一的手法は存在しません。このようなメソッドは、さまざまな実験的設定のこれらの重要な自然免疫系の細胞に関する研究に必要です。あらゆる研究室で簡単に採用できる、ここで説明する方法は、気管支肺胞洗浄液や肺組織から肺胞マクロファージを採取し、体外を維持する簡素化されたアプローチです。肺胞マクロファージは、肺胞に付着性のセルとして主に発生する、ためこのメソッドの焦点は収穫と同定する前にそれらを外れです。肺は高度に血管の臓器、骨髄性とリンパ性の起源の様々 な細胞タイプに生息する、対話、および肺微小環境によって影響を受けています。ここで説明されている表面のマーカーのセットを使用して、研究者はことができます簡単かつ明確に他の白血球から肺胞マクロファージを区別し、下位アプリケーションにそれらを浄化します。ここを開発した培養法両方の人間をサポートするマウスの体外発育の肺胞マクロファージと分子・細胞の研究と互換性が。

Introduction

肺微小環境は精巧な空気の導管と血管を一意に複雑な生態系です。吸入空気は、血液-空気ガス交換が発生する、肺胞に達する前に気管と気管支、細気管支の多数の枝を通してを移動します。大気と直接相互作用は、呼吸の表面は浮遊粒子状物質や汚染物質の可能性のある有害な効果から保護を必要とします。物理的、化学的、免疫学的障壁の数は、肺を保護します。特に、食細胞呼吸面での展開は、重要な最初の行の防衛システムを提供しています。肺胞マクロファージ (AMs) 肺居住者食細胞の一種であるし、彼らは肺マクロファージ プールの大半を構成します。その名の通り、AMs は主に肺胞腔に局在しているし、常に周囲の雰囲気をサンプルし、歯槽の上皮1通信付着細胞として発生します。肺胞腔内の食細胞の 95% 以上は、定常状態の肺、AMs2、その組成は、炎症、感染症、または汚染物質への慢性露出により変わる可能性があります。

AMs は、全身の重要性のおよび/または肺に対してローカルにすることができる機能の広い範囲に参加します。例えば、AMs は肺の最適な機能と開発に不可欠です。免疫の監視;侵入する病原体と吸入粒子3,4,5,6,7細胞の残骸のクリアランス。AMs の対象の枯渇は、呼吸器系ウイルスや細菌4,8のクリアランスを阻害する知られています。食細胞と肺の恒常性の最初の行の擁護者としての役割のほか AMs 知られている T を引き出すことで抗原提示細胞細胞免疫9、として機能する鼻腔内ワクチン10の効果を増強し、肺移植11,12後肺制限自己免疫に影響を与えます。午前の機能の欠乏は、遺伝子の突然変異、悪性腫瘍や肺界面活性剤13,14のクリアランスを損なう感染から生じる条件 (PAP)、肺胞蛋白症にリンクされています。AMs の移植は今 PAP 15,16の治療のための治療法として検討されています。

AMs は、胚形成の間に由来して循環白血球2,17に置き換えることがなく一生肺に固執するに知られています。午前売り上げ高のさまざまなレベルがインフルエンザ ウイルス4、破壊的照射18、内毒素への暴露によって感染を含む特定の臨床状況で報告されている午前売り上げ高は恒常性の肺に、19、そして高齢者20。AMs は、自己を介して悪性増殖17,21, 更新すると考えられているが、いくつかの最近の研究は、単球が血管肺マクロファージ22,23の下の人口に上昇を与えることができることを主張これらの新たに変えられた肺のマクロファージの機能がの実験条件はまだ肺疾患定義しなければなりません。肺炎症シグナルと免疫制御機械間の平衡を維持しようとすると、潜在的に興味深い地域がさらに午前活性化のコンテキストで刺激の閾値を理解することです。

免疫制御の損失をもたらす生理学的または病理学的変化は、さまざまな臨床設定 (例えば、呼吸器感染症、炎症性肺疾患、肺線維化疾患) の評価に重要です。それにもかかわらず、AMs はますますインジケーターまたは肺健康11,24のも決定要因として認識されます。収穫、特性評価、および人間および前臨床マウスモデルから維持する AMs 統一プロトコルは現在、ありません。午前前駆体と表現型のコンセンサスの欠如と詳細な方法の不在は、肺の健康および病気の午前の解読の役割の主要な障害をされていた。次のプロトコルでは、決定的な識別、分離、および体外で文化大きく午前動作の理解を進めるし、AM 向けの診断および治療の調査を促進する戦略を提供しています。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) セントジョセフ病院と医療センター制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。 1. マウスの気管支肺胞洗浄 (BAL) 液から AMs の分離 ケタミン (87.5 mg/kg 体重) とキシラジン (12.5 mg/kg 体重) 腹腔内注射を介してカクテル 8 週齢 c57bl/6 マウスを anaesthetize します。マウスに達する反射の…

Representative Results

マウス AMs を識別するためにフローのフローサイトメトリーによるアプローチは、図 1に示すです。これは、表面マーカー他肺居住者又は肺に浸潤食から AMs を区別するに必要な最小セットの分析が含まれています。差分解析は、間質性マクロファージ、樹状細胞、好中球、単球、肺に発生する単球由来の肺マクロファージから AMs を識別するた?…

Discussion

AMs は、肺に生じる出生時と26全体の寿命を永続的な作成時間の長いリビング肺居住者マクロファージです。肺生理学7と病理12とその潜在的な肺の免疫24の予測における役割を認識しています。AMs 肺11,27で長期的な存在感があるので、活性化と免疫11,<sup…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

原稿を編集の支援ありがとうクレア プレンダーガスト。DKN はサポートされて研究でフリン財団から (#2095) を付与し、TM は国立衛生研究所 (R01HL056643 と R01HL092514) からの補助金によってサポートされています。DKN 手法を開発、研究をデザイン、そして書いた原稿;動物実験と臨床サンプル調達支援 OMSB 支援フローサイトメトリー解析・細胞のソーティング。TM は研究を監督し、原稿の見直し。

Materials

Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

Referenzen

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).

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Diesen Artikel zitieren
Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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