Summary

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Abstract

I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all’infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l’identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

Introduction

Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell’aria elaborata e sistema vascolare. L’aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l’atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l’atmosfera ambiente e comunicano con l’ epitelio alveolare1. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs2, cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l’esposizione cronica alle sostanze inquinanti.

AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell’omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l’antigene in suscitamento T delle cellule dell’immunità9, rafforza l’efficacia del vaccino intranasale10 e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l’infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP 15,16.

AMs sono noti per provenire durante l’embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l’infezione da influenza virus4, myeloablative irradiazione18, esposizione all’endotossina 19e20di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.

Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l’assenza di una metodologia dettagliata era stato l’ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center. 1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL) Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un’iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l’anes…

Representative Results

L’approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l’analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verif…

Discussion

AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l’ intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell’atti…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.

Materials

Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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