Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos
Summary
Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.
Abstract
Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.
Introduction
O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) são um tipo de fagócitos residente no pulmão, e eles compõem a grande maioria do grupo de macrófagos pulmonares. Como seu nome sugere, AMs são principalmente localizadas para o lúmen alveolar e ocorrem como células sésseis que constantemente a atmosfera ambiente da amostra e comunicar-se com o epitélio alveolar1. No estado estacionário, pulmões, mais de 95% dos fagócitos no espaço alveolar são AMs2, cuja composição pode alterar devido a inflamação, infecção ou exposição crônica aos poluentes.
AMs participarem em uma ampla gama de funções que podem ser locais para os pulmões e/ou de importância sistêmica. Por exemplo, AMs são essenciais para o desenvolvimento e o bom funcionamento dos pulmões; vigilância imunológica; e liberação de restos celulares, invadindo a patógenos e partículas inaladas3,4,5,6,7. Alvo de depleção de AMs é conhecida por prejudicar a liberação de vírus respiratórios e bactérias4,8. Além de seu papel como fagócitos e um defensores da primeira linha da homeostase pulmonar, AMs são conhecidos por funcionar como células apresentadoras de antígeno em suscitar T célula imunidade9, potencializando a eficácia da vacina intranasal10 e influenciando a auto-imunidade restrição pulmonar após transplante de pulmão11,12. Deficiência na função AM tem sido associada a lipoidoproteinose alveolar pulmonar (PAP), uma condição resultante de uma mutação genética, malignidade ou infecção que prejudica o apuramento de surfactantes pulmonares13,14. Transplante de AMs agora está sendo explorada como uma abordagem terapêutica para o tratamento de PAP 15,16.
MGA é conhecidas que se originam durante a embriogênese e a persistir nos pulmões durante toda a vida sem ser substituído por leucócitos2,17de circulação. Embora, volume de negócios AM é indetectável nos pulmões homeostáticos, diferentes níveis de volume de negócios AM têm sido relatados em determinadas condições clínicas, incluindo a infecção pela gripe vírus4, mieloablativo irradiação18, exposição a endotoxina 19e20anos. MGA é acreditadas para auto renovar através de um baixo grau de proliferação de17,21, mas alguns estudos recentes afirmam que os monócitos podem dar origem a uma população de pulmão intravascular macrófagos22,23 , sob condições experimentais, mas a funcionalidade destes recém-convertidos macrófagos pulmonares ainda têm de ser definidos em doenças pulmonares. Além disso, compreender o limiar de estímulo no contexto de ativação AM é uma área potencialmente interessante, como o pulmão tenta preservar um equilíbrio entre os sinais inflamatórios e a maquinaria imunorreguladores.
As alterações fisiológicas ou patológicas que levam à perda do Regulamento imune são importantes para avaliar em vários ambientes clínicos (por exemplo, infecções respiratórias, doença inflamatória pulmonar e doenças pulmonares fibróticas). Não obstante, AMs são cada vez mais reconhecidos como indicadores ou mesmo determinantes da saúde pulmonar11,24. Atualmente, existem protocolos não unificados disponível para colheita, caracterizando, e/ou manutenção AMs com os humanos e modelos pré-clínicos de murino. Falta de um consenso sobre AM precursores e fenótipos e ausência de uma metodologia detalhada tinham sido grande bloqueio em decifrar função (ões) de AM na doença e na saúde pulmonar. O seguinte protocolo oferece uma identificação definitiva, isolamento e em vitro cultura estratégia extremamente avançar a compreensão do comportamento de AM e facilitar estudos de diagnósticos e terapêuticos AM-alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira26. Seus papéis na fisiologia pulmonar7 e patologia12 e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar24 foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões11,27 e porque eles estão envolvidos…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Clare Prendergast para obter assistência com o manuscrito de edição. DKN é suportado por uma pesquisa conceder (#2095) da Fundação Flinn e TM é suportada por concessões do National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN desenvolveu os métodos, projetou o estudo e escreveu o manuscrito; OM assistida com estudos em animais e recolha de amostra clínica; SB assistida com fluxo cytometric análise e classificação de célula; TM supervisionou os estudos e revisão do manuscrito.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Referenzen
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