Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix
Summary
Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.
Abstract
Xeno-freie und vollständig definierte Bedingungen sind Schlüsselparameter für eine robuste und reproduzierbare Erzeugung von homogenen human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS). Die Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen auf Feeder-Zellen oder undefinierten Matrizen ist anfällig für Charge-Varianzen, pathogene Kontamination und Immunogenitätsgefahr. Die Verwendung der definierten rekombinanten humanen Laminin 521 (LN-521) -Matrix in Kombination mit xenofreien und definierten Medienformulierungen reduziert die Variabilität und ermöglicht die gleichmäßige Erzeugung von hiPS-Zellen. Der Sendai-Virus (SeV) -Vektor ist ein nicht-integrierendes RNA-basiertes System, wodurch Umstände vermieden werden, die mit dem potentiellen störenden Effekt auf die Integrationsvektoren der Genomintegrität verbunden sind. Darüber hinaus haben diese Vektoren eine relativ hohe Effizienz bei der Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten gezeigt. Darüber hinaus ermöglicht die enzymatische Einzelzell-Passage von Zellen eine homogene Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen ohne wesentliche Vorkenntnisse von StammzellenKultur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das umfangreich getestet und mit einem Fokus auf Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit entwickelt wurde, was eine robuste und praktische Möglichkeit zur Erzeugung definierter und xenofreier menschlicher HiPS-Zellen aus Fibroblasten bietet.
Introduction
Da die erste Ableitung von hiPS-Zelllinien von Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-Zellen haben ein nützliches Werkzeug für die Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffforschung und als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Zelltherapien in der regenerativen Medizin bereitgestellt 3 . Die hiPS-Zellkultur ist seit langem auf Co-Kultur mit Fibroblasten-Feeder-Zellen 4 , 5 oder auf Matrigel 6 und mit Medienformulierungen, die fötales Rinderserum (FBS) enthalten, abhängig. Batch-to-Batch-Varianzen sind eine häufige Konsequenz der undefinierten Natur dieser Kulturbedingungen, was zu unvorhersehbaren Variationen führt, was einen wesentlichen Beitrag zur Unzuverlässigkeit dieser Protokolle gibt 7 Die Entwicklung eines definierten Mediums wie zB essentielle 8 (E8) 8 und definierte Zellkulturmatrizen zum Beispiel LN-521 9 erlauben esS für die Etablierung hochreproduzierbarer Protokolle und Unterstützung bei der robusten Erzeugung und Pflege von homogenen HiFi Zellen 7 , 8 , 9 , 10 .
Entwicklung von integrationsfreien Umprogrammierungstechniken war ein Sprung nach vorne. Ursprünglich hing die Neuprogrammierung von retroviralen Vektoren ab, die zufällig in das Genom integriert wurden, mit störenden Auswirkungen auf die genomische Integrität 11 . Fortschritte bei der Reprogrammierung von Methoden umfassen die Entwicklung von RNA-basierten Vektoren. RNA-Vektoren haben einen Vorteil gegenüber der DNA-basierten Reprogrammierungsmethode, da eine unbeabsichtigte Integration durch genomische Rekombination nicht möglich ist 12 . SeV-Vektoren liefern eine hohe und transiente Expression exogener Faktoren durch einzelsträngige RNA ohne DNA-Phase 11 . Die von der SeV gelieferten UmprogrammierungsvektorenSind in der Zellexpansion verdünnt und scheiden schließlich aus der Kultur, die einen fußabdruckfreien Weg zur Umprogrammierung bietet. Danach ist die Aufrechterhaltung der Pluripotenz abhängig von der endogenen Expression der Pluripotenzgene 2 .
Als bahnbrechende hiPS-zellbasierte Therapien beginnen sich in klinische Studien zu bewegen, die Anforderungen an standardisierte Chargen, Reproduzierbarkeit und Sicherheit sind wesentliche Fragen, um 13 zu adressieren. Daher sollten Produkte tierischen Ursprungs vermieden werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von xenogenen Produkten mit dem Risiko einer nichtmenschlichen Pathogenkontamination verbunden. Auch Zellen, die in Gegenwart von tierischen Kulturkomponenten kultiviert wurden, haben gezeigt, dass sie nichtmenschliche Silicasäuren in Zellmembranen einfließen, die drohende, abgeleitete Zellen immunogen zu machen 14 . Daher ist die Notwendigkeit, xenogene Produkte zu eliminieren, notwendig für zukünftige klinische Aktivitäten. Dieses Protokoll gilt für xeNicht-freie und definierte Kultur in der Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen, die Zellen näher an klinische Compliance bewegen.
Dieses Protokoll beschreibt eine konsistente, hoch reproduzierbare und einfach zu bedienende Methode, die standardisierte HiPS-Zellen aus Fibroblasten erzeugt. Es bietet auch ein benutzerfreundliches Kultursystem für die Wartung von etablierten Hallo-Zellen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um mehr als 300 hiPS Zelllinien in der schwedischen nationalen menschlichen iPS Core-Anlage am Karolinska Institutet abzuleiten, von denen einige Zeilen zuvor beschrieben wurden 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche Erzeugung von mehreren klonal abgeleiteten hiPS-Zelllinien. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode zur Aufrechterhaltung und Erweiterung der etablierten hiPS-Zellen zuverlässig ist und mit wenig vorheriger Erfahrung der Stammzellkultur durchgeführt werden kann. Die enzymatische Einzelzell-Passage mit ROCKi zusammen mit der LN-521-Matrix ist bekannt, um Zellen als karyotypisch normal zu halten, pluripotent und leicht in der Lage zu differenzieren, w…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Förderern von SSF (B13-0074) und VINNOVA (2016-04134) unterstützt.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
Referenzen
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