Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521

Dal momento che la prima derivazione delle linee cellulari hiPS da Takahashi et al. ^{1 , 2} , le cellule hiPS hanno fornito uno strumento utile per la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e come materiale di origine per la generazione di terapie cellulari in medicina rigenerativa ³ . La coltura di cellule hiPS è da tempo dipendente dalla co-coltura con le cellule di alimentazione di fibroblasti ^{4 , 5} o su Matrigel ⁶ e con formulazioni di supporto contenenti serum bovino fetale (FBS). Le varianze batch-to-batch sono una conseguenza comune della natura indefinita di queste condizioni di coltura, con conseguente variazioni imprevedibili, che contribuiscono in modo significativo alla inaffidabilità di questi protocolli ⁷ . Lo sviluppo di un mezzo definito come Essential 8 (E8) ⁸ e le matrici di colture cellulari definite ad esempio LN-521 ⁹ , consentonoS per la creazione di protocolli altamente riproducibili e aiuti nella robusta generazione e manutenzione di cellule hiPS omologate ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Lo sviluppo di tecniche di riprogrammazione gratuite di integrazione è stato un salto in avanti. Originariamente, la riprogrammazione dipendeva da vettori retrovirali che sono stati integrati in modo casuale nel genoma con effetti disruptivi sull'integrità genomica ¹¹ . I progressi nelle metodologie di riprogrammazione includono lo sviluppo di vettori basati su RNA. I vettori RNA hanno un vantaggio rispetto al metodo di riprogrammazione basata sul DNA, poiché l'integrazione involontaria attraverso la ricombinazione genomica non è possibile ¹² . I vettori SeV forniscono un'elevatissima e transitoria di fattori esogeni attraverso RNA a singolo filamento senza una fase DNA- ¹¹ . I vettori di riprogrammazione consegnati dal SeVSono diluiti per tutta l'espansione cellulare e, infine, spurgati dalla cultura fornendo un metodo di riprogrammazione libero. Successivamente, la manutenzione della pluripotenza dipende dall'espressione endogena dei geni pluripotenziali ² .

Poiché pionieristici terapie a base di cellule hiPS stanno cominciando a passare a studi clinici, le richieste di lotti standardizzati, la riproducibilità e la sicurezza sono questioni essenziali per affrontare ¹³ . Pertanto, i prodotti di origine animale devono essere evitati. Ad esempio, l'uso di prodotti xenogeneici è stato associato al rischio di contaminazione degli agenti patogeni non umani. Inoltre, le cellule colte in presenza di componenti animali della coltura animale hanno dimostrato di incorporare acidi silici non umani nelle membrane cellulari che minaccia di rendere le cellule derivate immunogeniche ¹⁴ . Quindi, la necessità di eliminare i prodotti xenogeneic è necessaria per qualsiasi futura ricerca clinica. Questo protocollo si applica xeCultura priva di libertà e definizione nel mantenimento delle cellule hiPS che muovono le cellule più vicine alla conformità clinica.

Questo protocollo descrive un metodo coerente, altamente riproducibile e facile da usare che genera cellule hiPS standardizzate dai fibroblasti. Offre inoltre un sistema di coltura di facile utilizzo per la manutenzione di cellule hiPS stabilite. Questo protocollo è stato utilizzato per ricavare più di 300 linee di cellule hiPS nel centro nazionale svedese di iPS Core a Karolinska Institutet di cui alcune linee sono state precedentemente descritte ^{15 , 16} .