Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.
Yeteneğini belirli beyin bölgeleri ilgi izole etmek mekansal dağılımı korumaz doku ayırma teknikleri içinde engellemiştir. Sürecin kendisi ifade desenleri tek tek hücreleri içinde değiştirebilirsiniz çünkü bu tür teknikler da potansiyel gen ifade analizi eğ. Burada seçerek travmatik beyin hasarı (TBY) tarafından değiştirilmiş bir Nisl Protokolü ve sıçan beyin atlas rehberliğinde boyama (Kresil mor) kullanarak etkilenen belirli beyin bölgeleri toplamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemi açıklanmaktadır. LCM beyin bölgelerinde yerel konumlarını ve anatomik yerler belirli her bölgenin kimliği için kullanma yeteneği erişim sağlar. Bu amaçla, LCM daha önce beyin bölgesi belirli bir gen ifadesinde Tby incelemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı Tby kaynaklı değişikliklere incelenmesi farklı beyin bölgeleri içinde aynı hayvan gen ve mikroRNA ifadede izin verir. Bu iletişim kuralı prensipleri tadil ve genomik ifade diğer hastalık ve/veya hayvan modelleri inceleyerek çalışmalar geniş bir uygulanır.
Son derece karmaşık ve farklı hücre türleri1binlerce yüzlerce ile memeli beynidir. Nitekim, insan çalışmaları frontal korteks gibi bölgelerde yapısal göstermiştir ve işlevsel farklılıklar beyaz ve gri konuda ayrı ve farklı transkripsiyon profilleri2‘ de yansıtılır. Beyin heterojenite gen ifadesi verileri yorumlamak için büyük bir engel oldu ve beyin hasarı alanında. Bu belirsizlik içinde preklinik çalışmalar daha sonra başarısız olan klinik tedaviler beyin yaralanması3için yüzlerce neden olmuştur.
Travmatik beyin hasarı (TBY) incelemek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemleri kullanın-gen bozukluk sıçan beyin4hipokampüs, öğrenme ve hafıza5için esastır bir beyin bölgesi odaklanan, indüklenen. Yakalama lazer ve hem ölüyor ve nöronlar hayatta gen ekspresyonu analiz yeteneği bize Tby6‘ dan sonra stochasticity (nöronal hayatta kalma) sonucu belirlemede gen ifadesinde rolünün daha büyük bir anlayış verir. LCM teknikleri de genç ve atma fareler7’yi veya fareler8karşılaştırırken Hipokampal nöronlar Tby etkilerini keşfetmek için yararlı kanıtlanmış.
Son çalışmalarda, sıçan beyin olumsuz fareler ve yönetim işlevi (Yani frontal korteks9) ve Tby comorbidities ile ilişkili olan insan Tby hastalarda odaklanarak Tby tarafından etkilenen diğer bölgelerinde incelendiğinde; Bu comorbidities depresyon (nucleus accumbens10)numaralar›n› ve sirkadiyen ritim bozuklukları (suprachiasmatic çekirdeği11) içerir. Önceki çalışmalar, Huusko ve Pitkanen12 ve Drexel vd. 13 LCM gen ekspresyonu talamus ve hipotalamus incelemek için kullanılan. Bizim çalışma önceden bu gözlemler oluşturur ve dört diğer beyin bölgeleri içerir. Tby sonra indüklenen bölgeye özgü moleküler değişiklikler çalışmaya, belirlenmesi ve hücre tipleri bir LCM sistemini kullanarak bu bölgelerde elde uzmanlık kazanmak için gerekli. UV-kesme ve kızılötesi (IR) lazerler istenen beyin bölgeleri kesin mikrodiseksiyon için izin. Burada, biz nasıl sıçan beyin atlas14, stereotaksik koordinatları belirlemek ve differentially deneysel sıvı-perküsyon beyin yaralanması yöntemi tarafından etkilenen yakalama dört sıçan beyin bölgeleri lazer rehberliğinde bu LCM sistem kullanım tarif 4.
Memeli beyin moleküler çalışmalar için bir temel tekniği LCM haline gelmiştir. Bu makalede, IR ve UV kesme lazerler LCM sisteminde kullanarak herhangi bir memeli beyin bölgesinin genomik değişiklikleri yakalayabilir gösterilir. Bu bölgeler dahil olanlar Kresil mor veya Hematoksilen Eozin gibi geleneksel LCM uyumlu lekeleri ile tanımlanabilir. Sadece hücre örnekleri yeterli miktarda elde etmek için aynı zamanda RNA tüm tip-in aşağı akım için uygun bir kalite LCM örneklerinden izole etmek için lazer-yakalama işlemi ve yeteneği daha kalın 30 µm bölümlerinde kalem membran slaytlarda LCM gerçekleştirmek için hızını sağlar Genom analizi; Bu analizler microarrays16, PCR diziler17ve nicel gerçek zamanlı PCR18içerir.
Bizim veri LCM doku kullanmak çalışmaları için bir gerekçe sağlamak. Biz o miR-15b upregulated Hipokampus ve korteks (şekil 4) ama downregulated nucleus accumbens içinde ve fark Tby beyindeki etkileri anlayış biyolojik olarak uygun olmayabilir bulabilirsiniz. Bir önceki çalışma artar’nı kortikal nöronal yaralanma için olumsuz yanlısı hayatta kalma genler, Bcl-219gibi düzenleyen birkaç miRNAs overexpression sonucu önerdi. Hedef tarama analizi gösterir Bcl-2 de miR-15b tarafından düzenlenmiş; Böylece, mekanik bir açıklama neden bizim verileri göstermektedir beynin belirli bölgeler (yani, FCx) Tby için seçmeli olarak etkilenebilir. Çoğu genlerin birden çok miRNAs tarafından düzenlenir ve belirli hedef gen için herhangi bir miRNA değişiklikler birleştiriliyor zordur hatırlamak önemlidir. Ayrıca, bu verileri mikroRNA ve gen ifadesinde bazı değişiklikler bölgeye özgü beyin hasarı biyolojik kullanılabileceğini belirtmek. Nitekim, şu anda bu veri çalışmalarda kullanıyor nasıl yeni nöroprotektif uyuşturucu bileşikler antidepresan özellikleri ile differentially nöropsikiyatrik bozukluklar için bağlı beyin bölgeleri mikroRNA ve gen ifadesinde etkileyebilir. Bir çalışmamız slayt hazırlama işlemleri LCM için birden çok adımı sırasında RNA bütünlüğü tehlikeye haline kısıtlamasıdır. Bu iletişim kuralı RNA bozulması riskini azaltmak için gerekli adımları açıklar. İstatistik hesaplaması için kullanılan nispeten küçük örnek boyutu başka bir kısıtlamadır. Gelecekte örnek boyutunu artırma çalışmaları, gen ve miRNA ifade çeşitleri bireysel hayvanlar arasında etkilerini azaltmak gerekir.
LCM yararına insan hastalık ve hastalıklı dokuları20,21,22,23hayvan modelleri kullanarak translasyonel genomik çalışmalar gerçekleştirilmektedir. Belirli hücre popülasyonlarının yakalama yeteneği, farklı beyin bölgelerini transkripsiyon profilleri-cekti var olmak pek çok hücre tipleri bilinemez ve undecipherable bir karışımı. LCM yöntemlerle beyin yaralanması çalışmalarda şimdiki çabalar için beyin bölgesi belirli biyolojik betimlemek için ve nasıl onlar Tby biyolojik dolaşan ile ilişkilendirmek anlamaya neden olmuştur.
The authors have nothing to disclose.
Elizabeth Sumner bu el yazması düzenleme onun yardımını kabul etmek istiyoruz. Bu proje için finansman kısmen Moody Project tarafından translasyonel travmatik beyin hasarı araştırma ve RO1NS052532 için HLH için sağlandı.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |