Descriviamo l’uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l’analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.
La possibilità di isolare le regioni specifiche del cervello di interesse può essere impedita in tecniche di dissociazione del tessuto che non conservano la loro distribuzione spaziale. Tali tecniche inclinare anche potenzialmente analisi dell’espressione genica, perché il processo stesso può alterare i modelli di espressione in singole celle. Qui descriviamo un metodo di laser capture microdissection (LCM) per raccogliere in modo selettivo regioni specifiche del cervello colpite dalla ferita di cervello traumatica (TBI) utilizzando un Nissl modificate (viola di cresyl) che macchia protocollo e la Guida di un Atlante del cervello del ratto. LCM fornisce l’accesso a regioni del cervello nelle loro posizioni nativi e la possibilità di utilizzare reperi anatomici per l’identificazione di ogni regione specifica. A tal fine, LCM è stato utilizzato in precedenza per esaminare l’espressione di specifici geni di regione del cervello in TBI. Questo protocollo permette l’esame delle alterazioni indotte da TBI nell’espressione genica e microRNA in aree cerebrali distinte all’interno dello stesso animale. I principi del presente protocollo possono essere modificati e applicati a una vasta gamma di studi che esaminano l’espressione genomica in altre malattie e/o modelli animali.
Il cervello dei mammiferi è notevolmente complesso ed eterogeneo con centinaia di migliaia di tipi delle cellule1. Infatti, gli studi umani hanno dimostrato che in regioni come la corteccia frontale, strutturali e funzionali differenze nella materia bianca e grigia si riflettono nelle distinte e divergenti profili trascrizionali2. Eterogeneità di cervello è stato dei principali ostacoli per interpretare i dati di espressione genica e nel campo del trauma cranico. Questa ambiguità negli studi preclinici ha successivamente portato a centinaia di studi clinici non riuscite dei trattamenti per lesioni di cervello3.
Utilizziamo metodi laser capture microdissection (LCM) per studiare la ferita di cervello traumatica (TBI)-indotto disregolazione genica in ratto cervello4, concentrandosi sull’ippocampo, una regione del cervello che è essenziale per l’apprendimento e la memoria5. La capacità di cattura del laser e analizzare l’espressione genica sia morire che sopravvivere neuroni ci dà una maggiore comprensione del ruolo della variabilità stocastica nell’espressione genica nella determinazione del risultato (sopravvivenza neuronale) dopo TBI6. Tecniche di LCM si sono anche dimostrati utili per esplorare gli effetti di TBI a neuroni ippocampali quando si confrontano giovani e invecchiamento topi ratti o7 8.
In studi recenti, abbiamo esaminato altre regioni del cervello del ratto negativamente influenzato da TBI, con un focus sulle aree in ratti ed in pazienti TBI umani che sono associati con funzione esecutiva (cioè corteccia frontale9) e comorbidità TBI; Queste comorbidità includono depressione (cioè nucleo accumbens10) e disturbi del ritmo circadiano (di nucleo suprachiasmatic11). In studi precedenti, Huusko e Pitkanen12 e Drexel et al. 13 utilizzato LCM per esaminare l’espressione genica nel talamo e ipotalamo. Il nostro studio si basa su queste osservazioni precedenti e comprende quattro altre regioni del cervello. Per studiare i cambiamenti di regione-specific molecolari indotti dopo TBI, era necessario ottenere la competenza nell’individuare e ottenere tipi di cellule in queste regioni utilizzando un sistema di LCM. I laser di taglio UV e infrarossi (IR) consentono microdissection precisa di regioni cerebrali desiderata. Qui, descriviamo come utilizziamo questo sistema di LCM, guidato da coordinate stereotassiche nel ratto cervello Atlante14, per identificare e laser cattura quattro regioni del cervello del ratto differenzialmente sono interessati dal metodo di lesione sperimentale del cervello fluido-percussioni 4.
Per gli studi molecolari del cervello dei mammiferi, LCM è diventata una tecnica essenziale. Questo articolo dimostra che usando la combinazione dei laser taglio IR e UV nel sistema LCM può catturare cambiamenti genomici in qualsiasi regione del cervello dei mammiferi. Queste regioni comprendono quelli identificabili con macchie di LCM-compatibile convenzionali, come la viola di cresyl o ematossilina ed eosina. La velocità del processo di laser-acquisizione e capacità di effettuare LCM su più spessa 30 µm sezioni su penna membrana diapositive permette di ottenere non solo una quantità sufficiente di campioni di cellule, ma anche per isolare il RNA dai campioni di LCM di qualità adatta per tutti i tipi di utilizzatori a valle analisi genomica; Queste analisi comprendono microarrays16, PCR matrici17e quantitativa PCR in tempo reale18.
I nostri dati forniscono una spiegazione razionale per gli studi che utilizzano il tessuto di LCM. Troviamo che miR-15b è upregulated nell’ippocampo e corteccia (Figura 4) ma downregulated nel nucleus accumbens e possono essere biologicamente rilevanti per la comprensione degli effetti differenziali di TBI nel cervello. Uno studio precedente suggerito che aumenti di vulnerabilita ‘ neuronale corticale alla ferita da sovraespressione di diversi Mirna che regolano negativamente il pro-sopravvivenza dei geni, quali Bcl-219. Destinazione scansione analisi spettacoli Bcl-2 è anche regolata da miR-15b; così, i nostri dati suggeriscono una spiegazione meccanicistica per perché regioni specifiche del cervello (cioè, FCx) possono essere selettivamente vulnerabili a TBI. È importante ricordare la maggior parte dei geni sono regolati da Mirna multiple e correlare cambiamenti in qualsiasi uno miRNA ad un gene specifico obiettivo è difficile. Inoltre, questi dati indicano che alcuni cambiamenti nell’espressione genica e microRNA possono essere usati come biomarcatori di danno di cervello di regione-specific. Infatti, stiamo attualmente utilizzando questi dati negli studi di neuroprotective come nuovi composti con proprietà Antidepressive differenzialmente possono influenzare espressione genica e microRNA in regioni del cervello collegata a disturbi neuropsichiatrici. Una limitazione del nostro studio è che durante i passaggi più procedimenti di preparazione di diapositiva per LCM, può diventare compromessa l’integrità del RNA. Questo protocollo descrive le misure necessarie per ridurre il rischio di degradazione del RNA. Un’altra limitazione è la dimensione del campione relativamente piccolo usata per il calcolo statistico. In futuro gli studi, aumentando la dimensione del campione dovrebbero diminuire gli effetti delle variazioni di espressione genica e miRNA tra singoli animali.
Il beneficio di LCM è realizzato negli studi di genomici traslazionali utilizzando modelli animali di malattie umane e tessuti malati20,21,22,,23. Senza la capacità di catturare le popolazioni delle cellule specifiche, i profili trascrizionali di regioni differenti del cervello sarebbe un mix inconoscibile e indecifrabile di molti tipi delle cellule. Utilizzando metodi di LCM negli studi di lesione cerebrale ha portato a attuali sforzi per delineare biomarcatori specifici di regione del cervello e capire come essi correlare con biomarcatori di TBI in circolazione.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo riconoscere Elizabeth Sumner per il suo aiuto questo manoscritto di editing. Finanziamento per questo progetto è stato fornito in parte dal Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale e RO1NS052532 di HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |