우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.
관심의 특정 뇌 영역을 분리 하는 능력은 그들의 공간 분포를 보존 하지 않는 조직 분열 기법에서에 장애가 될 수 있습니다. 과정 자체 개별 셀에 식 패턴을 변경할 수 있기 때문에 이러한 기술 또한 잠재적으로 유전자 표정 분석을 왜곡. 여기는 수정된 Nissl (cresyl 바이올렛) 얼룩 프로토콜 및 쥐 뇌 아틀라스의 지도 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)에 의해 영향을 하는 특정 뇌 영역을 선택적으로 수집 하는 레이저 캡처 기정 (LCM) 방법에 설명 합니다. LCM 뇌 영역 그들의 기본 위치와 신분의 각 특정 지역에 대 한 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 기능에 액세스할 수 있습니다. 이 위해, LCM 이전 TBI에 두뇌 지역 특정 유전자 발현 검사에 사용 되었습니다. 이 의정서는 같은 동물 내에서 뚜렷한 뇌 영역에 유전자와 예측에 관한 식에서 TBI 유도 변경의 시험을 허용 한다. 이 프로토콜의 원칙 개정 고 다른 질병 및 동물 모델에서 게놈 식 조사 연구의 넓은 범위에 적용 될 수 있습니다.
포유류 두뇌는 너무나 복잡 하 고 셀 유형1의 수천 수백와 함께 이종. 실제로, 인간 연구를 담당, 등의 지역에서 구조 그리고 백색과 회색 문제에 기능적인 차이 고 분기 transcriptional 프로필2에 반영 됩니다. 두뇌가 유전자 표현 데이터를 해석 하는 주요 장애물이 되었습니다와 뇌 손상의 필드. 전 임상 연구에서이 모호성 이후 수백 뇌 부상3에 대 한 치료의 실패 한 임상 시험을 주도하 고 있다.
레이저 캡처 기정 (LCM) 메서드를 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)를 공부 하는 우리-유전자는 쥐 두뇌4, 해 마, 학습 및 메모리5필수적인 뇌 영역에 초점을 맞추고 dysregulation를 유도. 레이저 캡처 모두 죽어가 고 살아남는 신경 세포에 유전자 발현을 분석 하는 기능 TBI6후 결과 (신경 생존) 결정 유전자 발현에서 stochasticity의 역할의 이해를 제공 합니다. LCM 기술은 또한 젊고 노화 생쥐7 또는 쥐8비교할 때 hippocampal 신경에 TBI의 효과 탐험 하는 데 유용 입증 했습니다.
최근 연구에서 우리는 쥐와 인간의 TBI 환자 TBI comorbidities; 고 집행 기능 (즉, 담당9)와 관련 된 분야에 초점을 맞춘 TBI에 의해 부정적인 영향을 쥐 두뇌의 다른 지역 검사 이러한 comorbidities 우울증(예: 핵 accumbens10) 등 circadian 리듬 장애 (suprachiasmatic 핵11). 이전 연구, Huusko 및 Pitkanen12 , Drexel 외. 13 시상과 시상 하 부에 유전자 발현 검사 LCM을 사용. 우리의 학문이 이전 관측을 근간 하 고 4 개의 다른 뇌 영역을 포함. TBI 후 유도 지역별 분자 변화 연구, 식별 하 고 LCM 시스템을 사용 하 여이 영역에서 셀 형식을 취득 전문 지식을 얻을 하는 데 필요한 했다. UV-절단 및 적외선 (IR) 레이저 원하는 뇌 영역의 정확한 서 하실 수 있습니다. 여기, 우리가 어떻게 식별 하 고 차동 실험 유체 타악기 뇌 부상 방법에 의해 영향을 받는 캡처 4 쥐 뇌 영역 레이저 쥐 뇌 아틀라스14, stereotaxic 좌표에 의해 유도이 LCM 시스템 사용 설명 4.
포유류 두뇌의 분자 연구, LCM는 필수적인 기법 되고있다. 이 문서에서는 LCM 시스템에 IR 및 UV 절단 레이저의 조합을 사용 하 여 포유류 두뇌의 모든 지역에서 게놈 변화를 캡처할 수 있습니다 보여 줍니다. 이 지역 cresyl 바이올렛 이나 되며, 오신 등 기존의 LCM 호환 얼룩 식별 포함 됩니다. 레이저 캡처 프로세스와 펜 막 슬라이드에 두꺼운 30 µ m 섹션에 LCM을 수행 하는 능력의 속도 뿐만 아니라 충분 한 양의 세포 샘플을 얻을 뿐만 아니라 모든 종류의 다운스트림에 대 한 적합 한 품질의 LCM 샘플에서 RNA를 분리 수 있습니다. 게놈 분석; 이러한 분석 등 microarrays16, PCR 배열17, 양적 실시간 PCR18.
우리의 데이터는 LCM 조직을 활용 하는 연구에 대 한 근거를 제공 합니다. 보면 그 미르-15b upregulated 해 마와 대뇌 피 질 (그림 4) 하지만 핵 accumbens에서 downregulated 이며 생물학적으로 두뇌에 있는 TBI의 차동 효과의 이해에 관련 될 수 있습니다. 이전 연구는 부상으로 대뇌 피 질의 신경 취약성 증가 부정적인 Bcl-219등 프로 생존 유전자를 통제 하는 몇몇 miRNAs의 overexpression에서 결과 제안 했다. 대상 검색 분석 쇼 Bcl-2 미르-15b;에 의해 또한 통제 된다 따라서, 우리의 데이터 제안 왜 기계 설명 두뇌의 특정 지역 (즉,, FCx) 선택적으로 TBI에 취약할 수 있습니다. 그것은 대부분 유전자 여러 miRNAs에 의해 통제 된다 유전자를 특정 대상에 어떤 한 미르에 변화를 상호 연결 하는 것은 어려운 기억 하는 것이 중요. 또한, 이러한 데이터를 나타내는 유전자와 예측에 관한 식에서 특정 변화 지역별 뇌 손상의 생체로 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 현재이 데이터 사용 하 여 이러한 연구에서 새로운 신경의 항우울제 특성을 가진 약물 화합물 차동 영향을 미칠 수 정신병 무질서에 연결 된 두뇌 지구에서 유전자와 예측에 관한 식. 우리의 연구의 한 가지 한계는 LCM에 대 한 슬라이드 준비 프로세스의 여러 단계 중 RNA 무결성 있습니다 될 손상입니다. 이 프로토콜 RNA 저하의 위험을 완화 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 또 다른 한계 통계 계산을 위해 사용 되는 상대적으로 작은 샘플 크기입니다. 미래에 연구, 샘플 크기를 늘리면 개별 동물 중에서 유전자와 미르 식 유사의 효과 완화 해야 합니다.
LCM의 혜택은 인간의 질환과 질병 조직20,21,,2223의 동물 모델을 사용 하 여 변환 게놈 연구에서 실현 된다. 특정 세포 인구를 잡으려고 능력 없이 다른 뇌 영역의 transcriptional 프로필 많은 종류의 세포는 알 수 없는 및 undecipherable 믹스 것입니다. LCM 메서드를 사용 하 여 뇌 손상 연구에서 주도하 고 있다 현재 노력 두뇌 지역 특정 생체 윤곽을 그리 다 하 고 어떻게 그들이 TBI의 생체 순환 연관 이해 하.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 원고를 편집 하는 그녀의 도움에 대 한 섬 너 엘리자베스를 인정 하 고 싶습니다. 이 프로젝트에 대 한 자금 의해 제공 했다 일부는 무디 프로젝트 변환 외상 성 뇌 부상 연구 및 RO1NS052532 HLH 하.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |