我们描述了利用激光捕获显微切割, 获得不同的细胞群体的样本, 从各个脑区的基因和 rna 分析。这项技术可以研究大鼠脑部特定区域创伤性脑损伤的差异效应。
在不保留其空间分布的组织解除技术中, 能够分离出感兴趣的特定大脑区域的能力受到阻碍。这种技术也可能扭曲基因表达分析, 因为这个过程本身可以改变单个细胞的表达模式。在这里, 我们描述了激光捕获显微切割 (LCM) 方法, 以选择性地收集受创伤性脑损伤 (脑外伤) 的特定大脑区域, 使用改良的尼 (甲酚紫) 染色协议和指导的大鼠脑图谱。LCM 提供了进入他们的本地位置的大脑区域, 并有能力使用解剖地标来识别每个特定的区域。为此, LCM 已被用于研究脑外伤后脑区特异基因的表达。该协议允许检查在同一动物的不同脑区内, 创伤后诱发的基因改变和 rna 表达。本议定书的原则可以修改, 并适用于对其他疾病和/或动物模型中的基因组表达进行广泛研究。
哺乳动物的大脑是非常复杂和异构的, 有成百上千的细胞类型1。事实上, 人类研究表明, 在诸如额叶皮层, 白色和灰色物质的结构和功能上的差异反映在不同的和不同的转录配置文件2。大脑异质性一直是解释基因表达数据和脑损伤领域的主要障碍。临床前研究的这种含糊不清导致了数百例失败的治疗脑损伤的试验3。
我们使用激光捕获显微切割 (LCM) 方法研究大鼠脑外伤性脑损伤 (失调) 诱发的基因,4, 聚焦于海马体, 这是学习和记忆所必需的大脑区域5。激光捕获和分析基因表达的能力在死亡和幸存的神经元, 使我们更了解随机性在基因表达的作用, 确定的结果 (神经元生存) 后, 脑损伤6。LCM 技术也被证明是有用的探索的影响, 脑外伤的海马神经元时比较年轻和衰老小鼠7或大鼠8。
在最近的研究中, 我们检查了大鼠脑损伤后的其他区域, 重点放在大鼠和与执行功能相关的人颅脑外伤患者的区域 (即额叶皮质9) 和创伤性并存;这些并存包括抑郁症 (即伏隔核10) 和昼夜节律紊乱 (交叉核11)。在以前的研究中, Huusko 和 Pitkanen12和尔et al.13使用 LCM 检查丘脑和下丘脑的基因表达。我们的研究建立在这些先前的观察基础上, 包括四其他脑区。为了研究脑外伤后所诱导的区域特异分子的变化, 有必要利用 LCM 系统在这些地区识别和获取细胞类型方面获得专门知识。紫外线切割和红外线 (IR) 激光器允许精确的显微切割所需的大脑区域。在这里, 我们描述我们如何使用这个 LCM 系统, 在大鼠脑图集14的立体定位坐标下, 识别和激光捕获四大鼠脑区, 这是受实验性撞击脑损伤方法的差异影响4。
对于哺乳动物大脑的分子研究, LCM 已经成为一种必不可少的技术。本文论证了在 LCM 系统中使用 IR 和 UV 切割激光器的组合可以捕获哺乳动物大脑任何区域的基因组变化。这些区域包括那些与传统的 LCM 相容的污渍, 如甲酚紫罗兰或苏木精和曙红。激光捕捉过程的速度和能力执行 lcm 对厚30µm 节的钢笔膜幻灯片不仅可以获得足够数量的细胞样本, 而且还可以分离 RNA 从一个合适的质量 lcm 样品的所有类型的下游基因组分析;这些分析包括微阵列16, pcr 数组17, 定量 real-time pcr18。
我们的数据为使用 LCM 组织的研究提供了理论依据。我们发现, miR-15b 是上调在海马和皮质 (图 4), 但 downregulated 在伏隔核和可能是生物学相关的理解的差异效应的脑外伤。先前的一项研究表明, 皮质神经元易受伤害的增加是由于一些 rna 的过度表达而导致的, 如 Bcl-219, 对 pro-survival 基因有负调节作用。目标扫描分析显示 Bcl-2 也受 miR-15b;因此, 我们的数据提出了一个机械的解释, 为什么特定区域的大脑(即, FCx) 可能有选择性地易受创伤性脑损伤。重要的是要记住, 大多数基因是由多个 rna 和相关的变化, 任何一个 miRNA 的特定靶基因是困难的。此外, 这些数据表明, 基因和 rna 表达的某些变化可能被用作区域特定脑损伤的生物标志物。事实上, 我们目前正在使用这些数据, 研究新的抗抑郁药物化合物如何能在与神经精神紊乱相关的脑区中对基因和 rna 表达产生差异性影响。我们研究的一个限制是, 在 LCM 的幻灯片准备过程的多个步骤中, RNA 完整性可能会受到影响。本协议描述了减少 RNA 降解风险的必要步骤。另一个限制是用于统计计算的较小样本大小。在今后的研究中, 增加样本量应能减少个体动物之间基因和 miRNA 表达变化的影响。
利用人类疾病和病变组织动物模型进行转化基因组研究中的 LCM 的好处20,21,22,23。如果没有能力捕捉特定的细胞群, 不同脑区的转录谱将是许多细胞类型不可知和难以的混合。使用 LCM 方法的脑损伤研究已经导致目前的努力, 划定脑区的特定生物标记物, 并了解它们是如何与循环生物标志化合物的创伤。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢伊丽莎白的帮助编辑这份手稿。该项目的资金部分由穆迪项目的转化性颅脑损伤研究和 RO1NS052532 HLH。
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |