En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans

Dispositifs microfluidiques fournissent un accès accru à précisément les environnements maîtrisés, où animaux, tels que le nématode c. elegans, peut être manipulée expérimentalement¹. Ces études comprennent des tests comportements, études d’imagerie calcique ou même des projections pour les phénotypes spécifiques, résultant en des mesures plus exactes des résultats expérimentaux^{1,2,3,4, 5,6}. Microfluidique offrent des conditions liquides à petite échelle à travers lequel les expériences détaillées peuvent être exécutées tout en utilisant des quantités minimales de réactifs. Il y a une production constante de nouvelles conceptions de dispositif microfluidique, et l’utilisation de chacun varie, entre les arènes permettant le mouvement naturel sinusoïdal de c. elegans , des essais comportements et des études d’imagerie neuronales piéger les appareils utilisés en imagerie neurale et études olfactifs, aux appareils qui permettent de haut débit analyse phénotypique en génétique écrans^4,5,6,7. Suite à la fabrication d’un moule maître, Dispositifs microfluidiques sont peu coûteux à construire, compte tenu de la réutilisabilité du maître — et facile à utiliser, permettant la génération de données rapide via des études de haut débit. La fabrication des dispositifs à l’aide de polymères comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) permet la création de nouveaux dispositifs dans les heures.

Études d’imagerie calcique utilisent des indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) exprimés dans les cellules de cible pour mesurer la dynamique neuronale de ces cellules en temps réel^8,9,10,11. La nature transparente de c. elegans permet l’enregistrement des niveaux fluorescents de ces protéines dans les animaux vivants. Traditionnellement, GECIs dépendent de la protéine fluorescente verte (GFP)-base de capteur GFP-calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), bien que des études plus récentes ont adapté ces capteurs permettant de meilleurs ratios signal-bruit et profils d’excitation décalée vers le rouge. Suite au développement de GCaMP3, avec ces spécifications, les protéines ont varié, y compris les capteurs tels que GCaMP6s et GCaMP6f (lent et rapide de fluorescence hors-taux, respectivement), ainsi que de la DP-calmoduline-M13 Peptide (Patriot04), qui a une décalée vers le rouge Profil de l’activation. La combinaison de ces GECIs avec séquences promotrices de c. elegans gène spécifique des cellules peut cibler des cellules d’intérêt, les neurones sensoriels en particulier^{12,13,14,15 , 16}.

Alors que la facilité d’utilisation de c. elegans en microfluidique études est apparente, presque toutes les études ont porté sur les hermaphrodites. Malgré les hommes représentaient seulement 0,01-0,02 % de la population de souche sauvage, conclusions inestimable peuvent découler de leur caractérisation. Tandis que le connectome physique du système nerveux hermaphrodite a été entièrement localisé pour des décennies¹⁷, le mâle connectome reste incomplète, en particulier dans la région céphalique des animaux¹⁸. L’utilisation d’imagerie calcique chez les mâles aideront à créer une compréhension du système nerveux mâle et les différences qui surviennent entre les deux sexes. La petite taille des mâles adultes de c. elegans empêche un piégeage efficace et fiable dans les ports de chargement des appareils olfactifs traditionnels conçus pour agrandissement hermaphrodites. Pour y remédier, une version modifiée de la puce olfactif Chronis¹⁹ a été développée avec un orifice de chargement plus étroit, une hauteur inférieure à canal et se transforme dans l’orifice de chargement du ver (qui tournent l’animal), permettant la visualisation de bilatérale gauche/droite paires neuronales. Cette conception permet : (1) le recouvrement efficace de jeunes mâles adultes, (2) une orientation plus fiable de l’animal pour la visualisation des deux membres de neurones paires bilatérales et (3) l’imagerie précise de l’activité neuronale dans les neurones masculins.

De plus en plus, des études montrent que le c. elegans mâles réagissent différemment des hermaphrodites à une variété d’ascarosides (RRSA) ou nématode phéromones^{20,21,22,23 ,},²⁴. Par conséquent, développer une compréhension de la dynamique neuronale et les représentations au sein de la connectome mâle est devenu encore plus pertinente. Mâles de c. elegans contiennent 87 sexe neurones non présents dans les hermaphrodites^25,26, altérant la connectome en tant que-façons encore indéterminé. Être capable à l’image de ces dynamiques de neurones uniques nous permettra à mieux comprendre les réponses selon le sexe et représentations neurales.

Ce protocole décrit l’utilisation d’une puce olfactive adaptées au mâle pour l’imagerie neurale du mâle c. elegans chémosensation. Le neurone nociceptif QU’ASH répond sûrement à 1 M glycérol chez les mâles, conformes aux précédentes hermaphrodite études²⁷. Exposition à ascarosides peut provoquer des réponses qui sont variables d’un animal à l’autre, nécessitant un plus grand nombre d’animaux à tester. La réponse des neurones spécifiques aux mâles CEM a déjà été démontrée, par électrophysiologie et de calcium, imagerie, répondre variablement à ascaroside #3²³.