Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Mikrofluidischen Geräte bieten verstärkten Zugang zu genau kontrollierten Umgebungen, wobei Tiere, wie z. B. der Fadenwurm C. Elegans, kann experimentell manipulierte¹sein. Diese Studien umfassen Verhaltens Assays, Kalzium bildgebenden oder sogar Vorführungen für bestimmte Phänotypen, wodurch genauere Messungen von experimentellen Ergebnissen^{1,2,3,4, 5,6}. Mikrofluidik bieten kleinen flüssigen Bedingungen durch die ausführliche Experimente ausgeführt werden können, während die Nutzung minimaler Mengen von Reagenzien. Gibt es eine konstante Produktion von neuen mikrofluidischen Gerätedesigns und die Verwendung der einzelnen variiert von Arenen, die für die natürliche sinusförmige Bewegung von C. Elegans in behavioral Assays und neuronale bildgebende Geräte in neuronale Bildgebung auffangen ermöglichen und olfaktorischen Studien, die Geräte, die für Hochdurchsatz-phänotypische Analyse in genetischen^4,5,6,7Bildschirme ermöglichen. Im Anschluss an die Herstellung von einem master-Form, mikrofluidischen Geräte sind preisgünstig zu konstruieren – angesichts die Wiederverwendbarkeit des Meisters — und einfach zu bedienen, so dass für schnelle Datengenerierung über Hochdurchsatz-Studien. Die Herstellung von Geräten, die Verwendung von Polymeren wie z. B. Polydimethylsiloxan (PDMS) ermöglicht die Erstellung von neuen Geräten innerhalb von Stunden.

Calcium bildgebenden mithilfe genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) ausgedrückt in Zielzellen der neuronalen Dynamik dieser Zellen in Echtzeit^8,9,10,11messen. Die transparentere Natur von C. Elegans ermöglicht die Aufzeichnung der fluoreszierenden Ebenen dieser Proteine in lebenden Tieren. Traditionell, GECIs verlassen sich auf das grün fluoreszierende Protein (GFP)-basierte Sensor GFP-Calmodulin-M13 Peptid (GCaMP), obwohl neuere Studien diese Sensoren für besseres Signal-Rausch-Verhältnis und rot-verschoben Erregung Profile angepasst haben. Im Anschluss an die Entwicklung der GCaMP3 Proteine mit diesen Spezifikationen haben unterschiedliche, einschließlich Sensoren wie GCaMP6s und GCaMP6f (langsame und schnelle Fluoreszenz ab-Preise, bzw.), sowie RFP-Calmodulin-M13-Peptid (RCaMP), die hat einen rot-verschoben Aktivierung-Profil. Die Kombination aus diesen GECIs mit C. Elegans zellspezifische gen Promotorsequenzen kann gezielt Zellen von Interesse, besonders sensorischen Neuronen^{12,13,14,15 , 16}.

Während die Benutzerfreundlichkeit C. Elegans in mikrofluidischen Studien hervorgeht, haben fast alle Studien auf Hermaphroditen konzentriert. Trotz Männchen entfallen nur 0,01-0,02 % der Bevölkerung Wildtyp, können wertvolle Erkenntnisse ergeben sich aus der Charakterisierung. Während der physischen Connectome Zwitter Nervensystem vollständig für Jahrzehnte¹⁷zugeordnet wurde, bleibt das männliche Connectome unvollständig, vor allem im Kopfbereich der Tiere¹⁸. Die Verwendung von Kalzium Bildgebung bei Männern wird mithelfen, schaffen ein Verständnis für die männlichen Nervensystems und die Unterschiede, die zwischen den beiden Geschlechtern auftreten. Die geringere Größe der Männchen C. Elegans verhindert effektiv und zuverlässig Fallenjagd in der Ladehäfen des traditionellen olfaktorischen Geräte für größere Hermaphroditen. Um dieses Problem anzugehen, eine modifizierte Version des olfaktorischen Chip Chronis¹⁹ wurde mit ein schmaler Verladehafen, eine niedrigere Kanalhöhe entwickelt und stellt sich in der Wurm Ladeöffnung (die das Tier zu drehen), ermöglicht die Visualisierung von bilateralen links/rechts neuronale Paare. Dieses Design erlaubt: (1) die effektive Trapping von jungen Erwachsenen Männern, (2) ein zuverlässiger Ausrichtung des Tieres für die Visualisierung von beide Mitglieder des bilateralen verbundenen Neuronen und (3) die präzise Abbildung der neuronalen Aktivität im männlichen Neuronen.

Immer mehr zeigen Studien, dass C. Elegans Männer anders als Hermaphroditen zu einer Vielzahl von Ascarosides (Ascr) oder Nematoden Pheromone^{20,21,22,23 reagieren ,24}. Daher entwickeln ein Verständnis der neuronalen Dynamik und Darstellungen innerhalb der männlichen Connectome noch relevant geworden. Männliche C. Elegans enthalten 87 geschlechtsspezifische Neuronen nicht vorhanden in der Zwitter^25,26, verändern das Connectome in als-noch unbestimmten Arten. In der Lage, diese einzigartige neuronale Dynamik Bild erlaubt uns, besser zu verstehen, geschlechtsspezifische Reaktionen und Neuronale Repräsentationen.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines männlichen angepasst olfaktorische Chips für die neuronale Bildgebung von männlichen C. Elegans Chemosensation. Die nozizeptiven Neuron Asche reagiert zuverlässig auf 1 M Glycerin bei Männern, konsistent mit früheren hermaphroditischen Studien²⁷. Exposition gegenüber Ascarosides kann Reaktionen hervorrufen, die Variable von Tier zu Tier sind, erfordern eine größere Anzahl von Tieren getestet werden. Die Antwort der männlich-spezifische CEM Neuronen zuvor, durch Elektrophysiologie und Kalzium, die bildgebenden Verfahren, nachweislich zu Ascaroside #3²³variabel reagieren.