Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans
Summary
O uso de um chip adaptado”olfativo” para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.
Abstract
A utilização de indicadores de cálcio tem bastante reforçada a nossa compreensão da dinâmica neural e regulamento. O nemátodo Caenorhabditis elegans, com sua anatomia transparente e completamente mapeado sistema nervoso apresenta um modelo ideal para a compreensão dinâmica neural em tempo real, usando indicadores de cálcio. Em combinação com tecnologias microfluídicos e projetos experimentais, estudos de geração de imagens de cálcio usando estes indicadores são realizados em animais em movimento livre e presos. No entanto, a maioria dos estudos anteriores utilizando dispositivos de captura, como o chip olfativo descrito no Chronis et al., têm dispositivos projetados para uso no hermafrodita mais comuns, como o macho menos comum é que ambos morfologicamente e estruturalmente dissimilares. Um chip adaptado olfativo foi projetado e fabricado para aumentar a eficiência no masculina imagem neuronal com o uso de animais jovens e adultos. Uma vez foi incorporada a minhoca porto para girar os animais e para permitir a separação dos neurônios individuais dentro de um par bilateral em 2D imagem de carregamento. Vermes são expostos a um fluxo controlado de odorante dentro do dispositivo microfluidic, conforme descrito em estudos anteriores de hermafrodita. Transientes de cálcio são então analisados utilizando o software open-source ImageJ. O procedimento descrito neste documento deverá permitir uma maior quantidade de macho com base em c. elegans cálcio estudos, aprofundar a nossa compreensão dos mecanismos de sinalização neuronal do sexo-específico de imagem.
Introduction
Dispositivos microfluídicos fornecem maior acesso a precisamente ambientes controlados, onde animais, tais como o nemátodo c. elegans, pode ser manipulado experimentalmente1. Estes estudos incluem ensaios comportamentais, estudos de imagiologia de cálcio ou mesmo sessões de fenótipos específicos, resultando em medidas mais exatas de resultados experimentais1,2,3,4, 5,6. Microfluídica proporcionar condições líquidas em pequena escala, através do qual as experiências detalhadas podem ser executadas utilizando quantidades mínimas de reagentes. Há uma produção constante de novos designs de dispositivo microfluidic, e o uso de cada um varia, de arenas que permitem o movimento natural sinusoidal de c. elegans em ensaios comportamentais e estudos de imagiologia neurais, capturar dispositivos utilizados em imagiologia neural e estudos olfativos, dispositivos que permitem alta produtividade análise fenotípica em genética telas4,5,6,7. Após a fabricação de um molde mestre, dispositivos microfluídicos são baratos construir — dada a capacidade de reutilização do mestre — e fácil de usar, permitindo a geração de dados rápida, através de estudos de alto rendimento. Fabricação de dispositivos usando polímeros tais como polydimethylsiloxane (PDMS) permite a criação de novos dispositivos dentro de horas.
Estudos de imagiologia de cálcio usam indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) expressados em células-alvo para medir a dinâmica neural essas células em tempo real8,9,10,11. A natureza transparente da c. elegans permite a gravação dos níveis fluorescentes destas proteínas em animais vivos. Tradicionalmente, GECIs dependem da proteína verde fluorescente (GFP)-baseado sensor peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), embora estudos mais recentes adaptaram estes sensores para permitir melhor relação sinal-ruído e perfis de excitação avermelhado. Após o desenvolvimento de GCaMP3, proteínas com estas especificações têm variado, incluindo sensores tais como GCaMP6s e GCaMP6f (lento e rápido fluorescência fora-taxas, respectivamente), bem como de peptídeo de RFP-calmodulina-M13 (RCaMP), que tem um avermelhado Perfil de ativação. A combinação destes GECIs com sequências de promotor de genes célula específica de c. elegans pode atingir células de interesse, neurônios sensoriais particularmente12,13,14,15 , 16.
Enquanto a facilidade de uso de c. elegans em estudos microfluídicos é aparente, quase todos os estudos têm incidido sobre hermafroditas. Apesar dos machos apenas contabilização de 0,01-0,02% da população de tipo selvagem, inestimáveis conclusões podem surgir de sua caracterização. Enquanto a conectoma física do sistema nervoso hermafrodita foi totalmente mapeada por décadas17, a conectoma masculina permanece incompleta, especialmente na região da cabeça do animal18. O uso de imagens de cálcio em machos vai ajudar a gerar uma compreensão do sistema nervoso masculino e as diferenças que surgem entre os dois sexos. O menor tamanho de c. elegans machos adultos evita armadilhas eficaz e confiável nos portos de carregamento dos tradicionais dispositivos olfativos projetados para maiores hermafroditas. Para resolver isso, uma versão modificada do Chip Olfactory Chronis19 foi desenvolvida com um porto de carregamento mais estreito, uma altura inferior do canal e se transforma no worm Porto de carregamento (que giram o animal), permitindo a visualização de esquerda/direita bilateral neuronais pares. Este projeto permite: (1) a captura efetiva de jovens adultos do sexo masculino, (2) uma orientação mais confiável do animal para a visualização de ambos os membros de neurônios emparelhados bilaterais e (3) a imagem precisa de atividade neural em neurônios masculinos.
Cada vez mais, estudos mostram que os machos de c. elegans respondem de forma diferente do que hermafroditas para uma variedade de ascarosides (ascr), ou o nematódeo pheromones20,21,22,23 ,24. Portanto, desenvolver uma compreensão da dinâmica neural e representações dentro a conectoma masculina tornou-se ainda mais pertinente. Masculino c. elegans contêm 87 neurônios específicos do sexo não está presentes no hermafrodita25,26, alterando a conectoma em como-maneiras ainda indeterminados. Sendo capaz de imagem essas dinâmicas neurais exclusivas nos permitirá compreender melhor respostas específicas do sexo e representações neurais.
Este protocolo descreve o uso de um chip olfativo macho-adaptado para a imagem neural de masculino c. elegans chemosensation. O neurônio nociceptivo que Ash responde confiantemente ao glicerol 1m em machos, consistentes com as anteriores hermafrodita estuda27. Exposição de ascarosides pode eliciar respostas que são variável de animal para animal, que requerem um maior número de animais a ser testado. A resposta dos neurônios CEM macho-específico anteriormente mostrou, através de eletrofisiologia e cálcio de imagem estudos, reagir variàvel ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
O chip olfativo macho-adaptado incorpora uma vez em um porto de carregamento mais estreito, o que permite maior controle da orientação e para a captura eficiente de masculino c. elegans. Isto permite a visualização de ambos os membros direito e esquerdos da neuronais pares bilaterais, sem a necessidade de empilhamento z. Esta curva leva a uma orientação longe vertical 100% do tempo em worms, onde destina-se apenas um par bilateral com um marcador fluorescente, como o ASH (Figura 2D</st…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Manuel Zimmer nos fornecendo o arquivo de projeto inicial que foi adaptado para uso com machos; Frank Schroeder para a síntese e o fornecimento da ascr #3; Ross Lagoy para o insight e assistência de imagem e análise; e Laura Aurilio para a fabricação de mestre e que, ao lado de Christopher Chute, contribuiu para a revisão deste manuscrito. Financiamento para este trabalho foi fornecido sob concessão do National Institutes of Health 1R01DC016058-01 (J.S.), a concessão do National Science Foundation CBET 1605679 (D.R.A.) e o prémio de carreira Burroughs Wellcome em Interface científica (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
Referenzen
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