Summary

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Published: April 22, 2017
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Summary

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

Abstract

배반포 (일반적으로 일 E3.5에서)의 내부 물질로부터 격리 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 초기 배아 발달을 연구하기위한 체외 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)가 없을는 ESC를 신경 전구 세포로 분화 기본적. 이들은 인해 초기 단계 배아의 유사성 구형 집합체 배아 체 (EB)을 지칭 삼차원 (3D)에 축적 될 수있다. 교환 사채는 두 가지 차원 (2D) 확장을 성장으로 확장 곳, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립에 시드, 또는 그들이 회전 타원체로 성장을 계속하고 3 개 개의 배엽으로 분화 3D 콜라겐 매트릭스에 이식 할 수 있습니다 내배엽, 중배엽과 외배엽. 3 차원 콜라겐 문화는 2D 사채보다 더 밀접하게 생체 내 환경을 모방. 2 차원 EB 문화는 면역과 차별화를 추적하기 위해 면역 블에 의해 분석을 용이하게합니다. 우리는 두 단계 신경 differentia을 개발했다기 프로토콜입니다. 첫 번째 단계에서, 사채 동시에, 레티노 산 (RA)에 대한 노출에 의해 분화 유도되고, 상기 걸이 드롭 방법에 의해 발생하고있다. 두 번째 단계에서, RA의 부재 2D 또는 3D 포맷에서 신경 분화를 진행한다.

Introduction

는 ESC는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래. 그들이 기원의 유기체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고 즉,이 세포는 만능이다. ESC 체외 분화 발달 경로와 메커니즘을 조사하는 실험적인 시스템으로 폭 넓은 관심이다. 그것은 세포와 조직 기능 장애의 교정을위한 새로운 치료 방법을 테스트 할 수있는 강력하고 유연한 모델 시스템을 제공합니다. 교환 사채는 초기 배 발생 동안 세포 분화의 여러 측면을 요점을 되풀이. 배아 치사가 어려운 배아 결함 (1, 2)의 셀룰러 기반을 결정하게 될 때 특히 EB를 사용할 수있다. 사채가 매달려 드롭 또는 액체 현탁액 기술 (3) 중 어느 하나를 형성 할 수있다. 전자의 이점은, 따라서 실험 재현성을 용이 일관된 크기 및 밀도 사채를 생성하는 능력이다.

<p c아가씨 = "jove_content는"> 세포 외 기질 (ECM) 접착 단백질과의 상호 작용이 부착 세포의 운동성 및 생존에 영향을 미칠 수있다. 2 차원 배양 시스템에있어서, 피브로넥틴은 종종 기판과 세포 접착을 증가인가된다. 피브로넥틴은 이종 4 인테그린 세포 표면의 10 개 종류로 인식 기저판 성분이다.

RA는 신경 분화 (5, 6)을 유도하는 비타민 A의 작은 친 유성 대사 산물이다. RA 고농도 신경 유전자 발현을 촉진하고 EB 형성 7, 8 중 중배엽 유전자 발현을 억제한다. RA는 레티 날 탈수소 효소 (9)에 의해 최종 제품 레티 산화 다음 중 알코올 탈수소 효소, 레티놀, 레티 날에 의해 산화 비타민 의해 제조된다. 신경 분화는 세포질에서 RA의 전송을 필요로 셀룰러 RA 결합 단백질 2 (CRABP2)에 의한 핵. 핵에서, RA는 RAR-RXR 헤테로 10 이루어진 동종 수용체 복합체에 결합한다. 이 전사 공동 활성제의 모집 및 전사 (9), (11)의 시작을 초래한다. 또한, RA 따라서 BMP 및 SMAD 12 시그널링 길항 인산화 (활성) SMAD1의 분해를 촉진시킨다. 이러한 활동 외에, RA는 PAX6 식 신경 분화 13을지지하는 전사 인자를 증가시킨다. RA 시그널링 시르-1 (SIRT1) 핵 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드 (NAD +)에 의해 변조되고, – 핵으로의 전좌 방해 CRABP2을 deacetylates 의존성 효소, 따라서 RA가 RAR-RXR 헤테로 14 (15)에 결합하여, (16).

e_content은 "> 여기에 설명 된 RA 처리 EB 프로토콜을 설계하는 우리의 목표는 신경 전구 세포에 ESC 분화를 조절하는 신호 전달 경로의 체외 분석을 용이하게하기 위해 신경 분화를 최적화하는 것입니다.이 프로토콜의 장점 중 하나의 촉진이다 면역. 3D 사채 의한 세포 기능의 분석은 또한 항체 관통 신경 분화를 공 초점 현미경에 의해 immunolabeling 및 세포 이미징을 용이하게하는 동안 특정 시점에서 2 차원 단층으로 이미지. EB 해리하기 어려운 것은 아니다.

Protocol

마우스 배아 섬유 아 세포의 (1) 문화 (MEFs에) MEF 매체를 준비, 15 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM, 고 글루코스). 실온에서 30 분 (RT) 0.5 % 젤라틴 용액 코트 100mm 세포 배양 접시. 세포 계측기를 사용하여 MEFs에를 계산합니다. 젤라틴 용액을 제거하고 즉시 MEF 매체는 37 ° C로 미리 예열 붓는다. 급속 다음, 2 분 동안 37 ° C의 물 배스에서 마이 토마 이?…

Representative Results

Oct4는, Nanog를, 및 SOX2는 ESC 자기 갱신과 다 능성을 부여하는 핵심 전사 인자이다. 우리는 야생형과 SYX 상기에서 RhoA 특정 과거 SYX 인자를 코딩하는 유전자가 파괴되어 유전자 변형 마우스의 균주는 ESC의 신경 분화를 비교하기 위해 상기 프로토콜을 적용 하였다. 우리는 혈관 신생 18 SYX을 내포했다. – / -는 ESC를하고 SYX의 신경 ?…

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 생쥐는 ESC의 신경 분화를 연구하는 비교적 간단한 접근 방법을 제시한다. 이전의 프로토콜에서는, RA가 제 2 일 또는 EB 매달려 드롭 (8)의 제 4 일 또는 현탁 배양 물 (7)을 배지에 첨가하고, EB 드롭 집합 (21)에 걸려 각각 또는 직후. 우리가 고안 한 프로토콜에서, RA는 이전 하였다. 현탁 배양에 의해 형성 사채 RA의 초기 도…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 AH에 NIH 보조금 R01 HL119984에 의해 지원되었다

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

Referenzen

  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

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Diesen Artikel zitieren
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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