Summary

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Published: April 22, 2017
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Abstract

Embryonale Stammzellen der Maus (WSR) von der Innenmasse der Blastozyste isoliert ( in der Regel am Tag E3.5) können für die Untersuchung der frühe Embryonalentwicklung als invitro – Modellsystem verwendet werden. In Abwesenheit von Leukämie-Hemmfaktor (LIF), unterscheidet WSR standardmäßig in neuralen Vorläuferzellen. Sie können in einer dreidimensionalen (3D) angehäuft werden, um sphärische Aggregat bezeichnet Embryoidkörperbildung (EB) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem frühen Stadium Embryo. EBs auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser ausgesät werden, wo sie von wachsenden zweidimensionale (2D) Erweiterungen oder implantiert in 3D-Kollagen-Matrices erweitern, wo sie als Sphäroiden weiter wachsen und differenzieren sich in die drei Keimblätter: endodermisches, mesodermalen und ektodermalen. Die 3D – Kollagen Kultur ahmt die invivo – Umgebung näher als der 2D – EBs. Die 2D-EB Kultur erleichtert Analyse von Immunfluoreszenz und Immunoblotting Differenzierung zu verfolgen. Wir haben einen zweistufigen neuronalen Differenzierung entwickeltmunikationsprotokoll. Im ersten Schritt wird EBs durch die Hanging-Drop-Technik erzeugt werden, und, gleichzeitig, induziert durch Exposition gegenüber Retinsäure (RA) zu differenzieren. Im zweiten Schritt, neuronalen Differenzierung erfolgt in einem 2D- oder 3D-Format in Abwesenheit von RA.

Introduction

WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embryonalen Defekte 1, 2 zu bestimmen. EBs können 3 durch den hängenden Tropfen oder flüssigen Suspensionstechniken gebildet entweder werden. Der Vorteil des ersteren ist die Fähigkeit, EBs konsistenter Größe und Dichte zu erzeugen, so dass experimentelle Reproduzierbarkeit zu erleichtern.

<p class = "„jove_content“"> Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix (ECM) Adhäsionsproteine ​​kann die Beweglichkeit und das Überleben von adhärenten Zellen beeinflussen. In dem 2D-Kultursystem wird oft Fibronektin zu erhöhen Zelladhäsion auf das Substrat aufgebracht. Fibronectin ist eine Basallamina Komponente um 10 Arten von Zelloberflächen – Integrin – Heterodimeren erkannt 4.

RA ist ein kleines lipophiles Metabolit von Vitamin A , das 5 neurale Differenzierung induziert, 6. Hohe Konzentrationen von RA Förderung neuronaler Genexpression reprimiert und mesodermalen Genexpression während der EB Bildung 7, 8. RA wird durch Vitamin – A – Oxidation Retinaldehyd entweder durch Alkohol oder Retinol – Dehydrogenase, gefolgt von Retinaldehyd Oxidation zum Endprodukt durch Retinaldehyd dehydrogenase 9 hergestellt. Neuronale Differenzierung erfordert Transport von RA aus dem Cytoplasma an den Kern durch zelluläre RA-bindendes Protein 2 (CRABP2). Im Kern bindet RA an seinen zugehörigen Rezeptor – Komplex , bestehend aus einem RAR-RXR – Heterodimer 10. Dies führt bei der Rekrutierung von Transkriptions Co-Aktivator, und der Initiation der Transkription 9, 11. Darüber hinaus fördert die RA den Abbau von phosphoryliertem (aktiv) SMAD1, wodurch BMP und SMAD Antagonisierung 12 signalisiert. Zusätzlich zu diesen Aktivitäten erhöht RA Pax6 – Expression, einen Transkriptionsfaktor, 13 neuralen Differenzierung unterstützt. RA – Signalisierung moduliert durch sirtuin-1 (Sirt1), ein Kern Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) – abhängiges Enzym , die CRABP2 deacetyliert, mit seiner Translokation in den Zellkern zu stören, und damit mit RA der Bindung an den RAR-RXR – Heterodimer 14, 15, 16.

e_content "> Unser Ziel der RA-behandelten EB – Protokoll bei der Gestaltung hier beschriebene neuronale Differenzierung zu optimieren , um invitro – Analyse der Signalwege zu erleichtern , die ESC Differenzierung in Zellen neuronalen Vorläufer regulieren. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Erleichterung der die Analyse der Zellfunktion durch Immunofluoreszenz. 3D EBs ist gut nicht durch Antikörper durchdrungen und ist schwer zu Bild. EB Dissoziation in einen 2D-Monolayer zu bestimmten Zeitpunkt während der neuronalen Differenzierung und Immunomarkierung Bildgebung der Zellen durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

Protocol

1. Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Bereiten MEF Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, high-glucose), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS). Coat 100 mm Zellkulturschalen mit 0,5% Gelatine-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Graf MEFs mit einem Durchflusszytometer. Entfernen der Gelatinelösung und sofort gießen MEF Medium vorgewärmt auf 37 ° C. Schnell auftauen Phiolen von Mitomycin C-behandeln MEFs in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min, d…

Representative Results

Oct4, Nanog und SOX2 sind die Kerntranskriptionsfaktoren, die ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wir wandten das obige Protokoll , um die neuronale Differenzierung von WSR vom Wildtyp und aus einem Stamm von genetisch veränderten Mäusen , wo Syx, ein Gen , kodierend für das RhoA spezifische exchange factor Syx, gestört zu vergleichen. Wir hatten Syx in 18 Angiogenese beteiligt. Wir bemerkten Unterschiede im Verhalten von EBs von Syx</…

Discussion

In diesem Protokoll stellen wir eine relativ einfache und zugängliche Methode neuronale Differenzierung von murinen WSR zu studieren. In vorangegangenen Protokollen wurde RA auf das Medium am Tag 2 oder Tag hinzugefügt 4 des EB hängenden Tropfen 8 oder durch Suspensionskultur bzw. 7, oder unmittelbar nach der Tropfenaggregation EB 21 hängt. In dem Protokoll wir erdacht wurde RA früher gegeben. Trotz der früheren Einführung von RA zu EBs durch…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von NIH Zuschusses R01 HL119984 zu AH unterstützt

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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