Summary

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em> 체외에서</em

Published: May 17, 2017
doi:

Summary

우리는 5- 메틸 시토신 (5-mC) 도트 블롯을 기반으로 DNA 메틸화를 정량화하는 방법을 제시합니다. 우리는 연골 세포 탈분화 동안 5-mC 수준을 결정했다. 이 간단한 기술은 ACI 치료에서 연골 세포 표현형을 신속하게 결정하는데 사용될 수 있습니다.

Abstract

섬유 연골 성 연골 세포로의 유리질 연골 세포의 탈 분화는 종종 체외에서 연골 세포의 단층 확장을 수반한다. 연골 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 표현형의 손실에 적합한 바이오 마커로 간주됩니다. 그러나 다른 실험 방법을 기반으로 한 결과가 일치하지 않을 수 있습니다. 그러므로 연골 세포의 탈분화 동안 전 세계적 DNA 메틸화 수준을 정량화하기위한 정확하고 간단하며 신속한 방법을 확립하는 것이 중요합니다.

현재의 게놈 전반의 메틸화 분석 기술은 주로 바이 설 파이트 게놈 시퀀싱에 의존합니다. 바이 설 파이트 전환 동안 DNA 분해로 인해, 이들 방법은 전형적으로 큰 샘플 체적을 필요로한다. 전반적인 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 데 사용되는 다른 방법으로는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 있습니다. 그러나, HPLC는 게놈 DNA의 완전한 소화가 필요합니다. 또한, HPLC의 비용이 엄청나게 높습니다.기구는 HPLC의 광범위한 적용을 제한합니다.

이 연구에서는 genomic DNA (gDNA)가 다양한 계대 배양으로 배양 된 인간 연골 세포로부터 추출되었다. gDNA 메틸화 수준은 메틸화 – 특이 적 도트 블롯 분석을 사용하여 검출되었다. 이 도트 블랏 접근법에서, 검출 될 메틸화 된 DNA를 함유하는 gDNA 혼합물을 이전에 그려진 원형 템플릿 패턴 내부의 도트로서 N + 막 상에 직접 점착시켰다. 다른 젤 전기 영동에 근거한 blotting 접근법과 다른 복잡한 blotting 절차와 비교하여, dot blot 방법은 상당한 시간을 절약합니다. 또한 도트 블랏은 상업적으로 이용 가능한 5-mC 항체를 사용하여 전체 DNA 메틸화 수준을 검출 할 수 있습니다. 우리는 DNA 메틸화 수준이 monolayer의 하위 문화 사이에 차이가 있음을 발견했으며, 따라서 연골 세포의 탈분화에 핵심적인 역할을 할 수있었습니다. 5-mC 도트 블랏은 일반 DNA 메틸화 수준을 평가하기위한 신뢰할 수 있고 간단하고 신속한 방법입니다e 연골 세포 표현형.

Introduction

Autologous chondrocyte implantation (ACI)은 관절 연골 결손을 치료하는 비교적 새로운 최첨단 절차입니다 1 , 2 . ACI의 중요한 단계 중 하나는 체외에서 단일 층 배양 통한 연골 세포의 증폭이다. 증폭 과정에서 유리 연골 세포는 쉽게 표현형을 잃어서 탈분화되어 ACI 치료에 바람직하지 못하다. ACI 치료의 결과를 최적화하기 위해, 연골 세포의 탈분화 정도를 재 접종 전에 결정해야합니다. 연골 세포의 상태를 결정하는 경제적이며 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 최근에 DNA 메틸화와 연골 세포 탈분극의 연관성이 주목을 받고있다 4 , 5 , 6 . DNA methylation은 wh의 과정이다.1 차 메틸기가 DNA에 추가되어 시토신 잔기가 5- 메틸 시토신 (5-mC)으로 전환됩니다.

연골 세포 탈분화의 DNA 메틸화 생물학을 밝히기 위해, 첫 번째 단계는 지금까지 도전적인 것으로 입증 된 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 평가하는 것입니다. Bisulfite 게놈 시퀀싱은 DNA 메틸화 분석에 가장 널리 사용되는 기술입니다 ( 7 , 8) . 이 분석에서 bisulfite 전환은 DNA 분해를 일으키므로 상당한 양의 시료를 분석에 제공해야합니다. 또한, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 전 지구 DNA 메틸화 수준 9 , 10 을 정량화하기 위해 사용되었습니다. 그러나 HPLC 분석에는 게놈 DNA 분해가 필요합니다. 또한, 고급 고비용 실험기구가 필요합니다. 따라서, 고비용 이외에, 이러한 실험 절차는 시간 단점음. 항 -m-5C 항체는 상업적으로 이용 가능하며, 복잡한 게놈으로부터의 5-mC- 함유 게놈 DNA의 면역 블 럿팅 가능성을 창출했다.

이 보고서에서 우리는 일련의 단층 배양에서 성장한 연골 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. 우리는 구절의 다른 번호와 인간의 연골 세포의 5-mC 콘텐츠를 평가하는 도트 블랏 분석을 사용합니다. 우리는 5-mC 함량이 낮은 등급의 탈분화를 가진 연골 세포에 비해 고도로 탈분화 된 연골 세포에서 증가한다는 것을 발견했다. 또한, 우리는 탈 분화 상태와 5-mC 수준 사이의 관계를 확인했습니다. 마지막으로 우리는 5-mC 함량의 변화가 연골 세포의 표현형과 관련이 있다고보고했다. 따라서 5-mC 도트 얼럿 분석은 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 검출하기위한 신뢰할 수있는 간단하고 신속한 방법입니다.

Protocol

이 연구는 심천 제 2 인민 병원 인간 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. 인간 관절 연골 조직 수집 및 연골 세포 배양 재료 준비 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 – 스트렙토 마이신이 보충 된 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지를 준비한다. 1 MG / ML collagenase II, 0.25 % 트립신 – EDTA, 인산 버퍼 식염수 (PBS), 셀 스트레이너 (40 μm 나일론)를 준비합?…

Representative Results

연골 세포는 6 층까지 단일 층으로 배양되었다 (P6). 연골 세포는 단층 세포 배양을 연속적으로 진행하면서 점진적인 표현형 변화를 보였다. P0 연골 세포 형태는 둥글었지만 반면에 세포는 P6까지의 연속적인 통로로 매우 꼬집어지고 평평 해졌다 ( 그림 1 ). 이 형태 변화는 연골 세포 탈분화 과정의 전형적인 현상입니다. 한편, 히트 맵의 결과는 장기 계대 배양?…

Discussion

체외에서 연골 세포 의 탈분화는 연골 결손의 치료에서 ACI의 결과를 심각하게 손상시킵니다 11,12. ACI 결과를 최적화하기 위해서는 탈분극 된 연골 세포 13 의 사용을 피하는 것이 중요합니다. 연구에 따르면 일반적인 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 탈분화의 정도와 관련이 있다고합니다. 따라서, 임상 적용 전에 연골 세포의 일반적인 DNA 메틸화 상태를 검출하는 신뢰성 있고 …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 다음과 같은 교부금에 의해 지원되었다 : 중국 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); 광동성 자연 과학 재단, 중국 (No. 2015A030313772); 중국 박사후 연구 재단 기금 프로젝트 (No. 2013M530385); 중국 광동성의 의학 연구 재단 (No. A2016314); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Materials

Reagents
DMEM   Gibco Inc. 11965–092 Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS) HyClone Inc. SH30256.01B D-PBS, free of 
Ca2+/Mg2+
FBS Gibco Inc. 10099-141
0.25%Trypsin/EDTA Gibco Inc. 25200-056
1%Penicillin-Streptomycin Gibco Inc. 15140-122
Chloroform Mallinckrodt 4440
Isoamyl Alcohol Sigma I-3643
Phenol Gibco BRL 15513-039
Proteinase K Gibco BRL 24568-2
TAE buffer  Bio Whittaker 16-011V
Distilled Water Gibco BRL 15230-170
1 M Tris-HCl Biosharp Inc. BL514A
Tween20 Biotopped Inc. C58H114O26
BSA Proliant Inc. 68700
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
Names      Company        Catalog number        Comments
Equipment
Cell Strainer(40μm nylon) FALCON Inc. 352340
Hemocytometer ISOLAB Inc. 075.03.001
Falcon 100 mm  dish Corning 353003
Centrifuge Tubes TPP AG 91050 Gamma-sterilized
High-speed centrifuge Eppendorf 5804R
ThermoMixer MIULAB MTH-100
Carbon dioxide cell incubator Thermo scientific 3111
Chemi-imaging Analyse System UVITEC Cambridge ALLIANCE

Referenzen

  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
  3. Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
  4. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
  6. Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
  7. Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
  8. Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
  9. Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
  10. Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
  11. Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
  12. Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
  13. Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
  14. Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
  15. Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
  16. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X., Xiong, J., Duan, L., Wang, D. A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro. J. Vis. Exp. (123), e55565, doi:10.3791/55565 (2017).

View Video