Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert<em> In Vitro</em
Summary
Wij presenteren een methode om DNA-methylering te kwantificeren op basis van de 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We bepalen de 5-mC niveaus tijdens chondrocyten dedifferentiatie. Deze eenvoudige techniek kan gebruikt worden om snel het chondrocytfenotype in ACI-behandeling te bepalen.
Abstract
De dedifferentiatie van hyalinechondrocyten in fibroblastische chondrocyten begeleidt vaak monolaaguitbreiding van chondrocyten in vitro . Het globale DNA-methyleringsniveau van chondrocyten wordt beschouwd als een geschikte biomarker voor het verlies van het chondrocytfenotype. Echter, resultaten op basis van verschillende experimentele methodes kunnen inconsistent zijn. Daarom is het belangrijk om een precieze, eenvoudige en snelle methode vast te stellen om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren tijdens chondrocytedifferentiatie.
Huidige genoomwijdte methyleeringsanalyse technieken vertrouwen grotendeels op bisulfiet genomische sequencing. Door DNA-afbraak tijdens de bisulfietomzetting, hebben deze methoden typisch een groot monstervolume nodig. Andere methoden die gebruikt worden om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren, omvatten hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC). HPLC vereist echter volledige vertering van genomisch DNA. Bovendien, de onvoorziene hoge kosten van HPLC inStruments beperkt HPLC's breder applicatie.
In deze studie werd genomisch DNA (gDNA) geëxtraheerd uit menselijke chondrocyten die werden gekweekt met verschillende aantal passages. Het gDNA-methyleringsniveau werd gedetecteerd onder gebruikmaking van een methyleringspecifieke dot blot analyse. Bij deze dot blot-aanpak werd een gDNA-mengsel dat het gemeten DNA bevat dat gedetecteerd werd, direct op een N + -membraan gezien als een punt in een eerder getekend cirkelvormig sjabloonpatroon. In vergelijking met andere gel-elektroforese gebaseerde blotting benaderingen en andere complexe blotting procedures, bespaart de dot blot methode significante tijd. Daarnaast kunnen dotbots het totale DNA-methyleringsniveau detecteren onder gebruikmaking van een in de handel verkrijgbaar 5-mC-antilichaam. We vonden dat het DNA-methyleringsniveau verschilde tussen de monolaagse subculturen en zou daarom een sleutelrol kunnen spelen bij chondrocytedifferentiatie. De 5-mC dot blot is een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het algemene DNA-methyleringsniveau te detecteren om te evaluerenE chondrocyt fenotype.
Introduction
Autologe chondrocyt implantatie (ACI) is een relatief nieuwe, state-of-the-art procedure voor het behandelen van articulair kraakbeen defecten 1 , 2 . Een van de cruciale stappen in ACI is de amplificatie van chondrocyten via de monolagcultuur in vitro . Tijdens amplificatie verlielen de hyaline chondrocyten hun fenotype gemakkelijk en worden gedifferentieerd, wat ongewenst is voor ACI-behandeling 3 , 4 . Om de uitkomst van ACI-behandeling te optimaliseren, moet de mate van chondrocytedifferentiatie worden bepaald voor replantatie. Het is essentieel om een economische en snelle manier vast te stellen om de status van chondrocyten te bepalen. Onlangs heeft de associatie tussen DNA methylatie en chondrocyt dedifferentiatie veel aandacht aangetrokken 4 , 5 , 6 . DNA methylering is een proces van whDe methylgroepen worden toegevoegd aan DNA, wat resulteert in de omzetting van cytosine residuen naar 5-methylcytosine (5-mC).
Om de biologie van DNA-methylering bij chondrocytedifferentiatie te verduidelijken, is de eerste stap het DNA-methyleringsniveau van chondrocyten, dat tot nu toe uitdagend is, te evalueren. Bisulfiet genomische sequencing is de meest gebruikte techniek om DNA-methylering 7 , 8 te analyseren. Bij deze analyse veroorzaakt bisulfietomzetting DNA-afbraak en moet dus een substantiële hoeveelheid monster voor de bepaling worden verschaft. Ook is een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gebruikt om de globale DNA-methyleringsniveaus 9 , 10 te kwantificeren. HPLC analyse vereist echter genomische DNA-vertering. Bovendien zijn geavanceerde en dure experimentele instrumenten nodig. Daarom zijn deze experimentele procedures naast de hoge kosten tijdsverschillenuming. Anti-5-mC-antilichamen zijn nu in de handel verkrijgbaar, wat de mogelijkheid tot immuun blotting van 5-mC-bevattend genoom DNA van complexe genen heeft gecreëerd.
In dit rapport hebben we genomisch DNA uit chondrocyten geëxtraheerd in een serie monolagenculturen geëxtraheerd. We gebruikten een dot blot analyse om het 5-mC gehalte in humane chondrocyten met verschillende aantallen passages te evalueren. We hebben geconstateerd dat 5-mC-inhoud is verhoogd in sterk gedifferentieerde chondrocyten in vergelijking met chondrocyten met laagwaardige dedifferentiatie. Daarnaast identificeerden we een relatie tussen dedifferentiatiestatus en 5-mC-niveaus. Tenslotte hebben we gemeld dat de veranderingen in 5-mC-inhoud geassocieerd zijn met het chondrocytfenotype. Daarom is de 5-mC dot blot-analyse een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het DNA-methyleringsniveau in chondrocyten te detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chondrocyten dedifferentiation in vitro compromiseert het resultaat van ACI ernstig in de behandeling van kraakbeen defect reparatie 11 , 12 . Om het ACI-resultaat te optimaliseren is het van cruciaal belang om het gebruik van gedifferentieerde chondrocyten 13 te vermijden. Studies hebben aangetoond dat algemeen DNA methyleringsniveau geassocieerd wordt met de mate van chondrocytedifferentiatie 4 ,</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: Stichting Natuurwetenschappen van China (nr. 81572198; nr. 81260161; nr. 81000460); Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Guangdong, China (nr. 2015A030313772); China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (nr. 2013M530385); De medische onderzoeksstichting van de provincie Guangdong, China (nr. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referenzen
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
