Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em> In vitro</em
Summary
Wir stellen ein Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Methylierung auf der Basis des 5-Methylcytosin (5-mC) -Dot-Blots vor. Wir haben die 5-mC-Werte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung bestimmt. Diese einfache Technik könnte verwendet werden, um schnell den Chondrozyten-Phänotyp in der ACI-Behandlung zu bestimmen.
Abstract
Die Dedifferenzierung von hyalinen Chondrozyten in fibroblastische Chondrozyten begleitet oft die Monolayer-Expansion von Chondrozyten in vitro . Der globale DNA-Methylierungsgrad von Chondrozyten gilt als geeigneter Biomarker für den Verlust des Chondrozyten-Phänotyps. Allerdings können die Ergebnisse auf der Grundlage verschiedener experimenteller Methoden inkonsistent sein. Daher ist es wichtig, eine präzise, einfache und schnelle Methode zu etablieren, um globale DNA-Methylierungswerte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung zu quantifizieren.
Die derzeitigen genomweiten Methylierungsanalysetechniken beruhen weitgehend auf der genomischen Sequenzierung von Bisulfit. Aufgrund des DNA-Abbaus während der Bisulfit-Umwandlung erfordern diese Verfahren typischerweise ein großes Probenvolumen. Andere Methoden zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierungsstufen umfassen die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Allerdings erfordert HPLC eine vollständige Verdauung der genomischen DNA. Darüber hinaus sind die unerschwinglich hohen Kosten der HPLC inStruments begrenzt die erweiterte Anwendung von HPLC.
In dieser Studie wurde genomische DNA (gDNA) aus menschlichen Chondrozyten extrahiert, die mit variierender Anzahl von Passagen kultiviert wurden. Der gDNA-Methylierungsgrad wurde unter Verwendung eines methylierungsspezifischen Dot-Blot-Assays nachgewiesen. Bei diesem Dot-Blot-Ansatz wurde eine gDNA-Mischung, die die zu detektierende methylierte DNA enthielt, direkt auf eine N + -Membran als Punkt innerhalb eines zuvor gezeichneten kreisförmigen Templatmusters gesichtet. Im Vergleich zu anderen Gelelektrophorese-basierten Blotting-Ansätzen und anderen komplexen Blotting-Prozeduren spart die Dot-Blot-Methode erhebliche Zeit. Zusätzlich können Punktblots den Gesamt-DNA-Methylierungsgrad unter Verwendung eines im Handel erhältlichen 5-mC-Antikörpers nachweisen. Wir fanden, dass sich der DNA-Methylierungsgrad zwischen den Monolayer-Subkulturen unterscheidet und daher eine Schlüsselrolle bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung spielen könnte. Der 5-mC-Dot-Blot ist eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode, um die allgemeine DNA-Methylierungsstufe zu ermittelnE-Chondrozyten-Phänotyp
Introduction
Die autologe Chondrozytenimplantation (ACI) ist ein relativ neues, hochmodernes Verfahren zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten 1 , 2 . Einer der entscheidenden Schritte in ACI ist die Verstärkung von Chondrozyten über die Monolayerkultur in vitro . Während der Amplifikation verlieren die hyalinen Chondrozyten leicht ihren Phänotyp und werden dedifferenziert, was für die ACI-Behandlung 3 , 4 unerwünscht ist . Um das Ergebnis der ACI-Behandlung zu optimieren, sollte das Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung vor der Wiederbepflanzung bestimmt werden. Es ist zwingend notwendig, einen wirtschaftlichen und schnellen Weg zu finden, um den Status der Chondrozyten zu bestimmen. In jüngster Zeit hat die Assoziation zwischen DNA-Methylierung und Chondrozyten-Dedifferenzierung viel Aufmerksamkeit erregt 4 , 5 , 6 . DNA-Methylierung ist ein Prozess von whIch werden der DNA zugesetzt, was zur Umwandlung von Cytosinresten zu 5-Methylcytosin (5-mC) führt.
Zur Aufklärung der Biologie der DNA-Methylierung bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung ist der erste Schritt die Auswertung der DNA-Methylierungsstufe von Chondrozyten, die sich bislang als herausfordernd erwiesen hat. Bisulfit-Genomsequenzierung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Analyse der DNA-Methylierung 7 , 8 . In diesem Assay verursacht die Bisulfitumwandlung einen DNA-Abbau, und daher muß eine beträchtliche Menge an Probe für den Assay bereitgestellt werden. Außerdem wurde eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet, um die globalen DNA-Methylierungsstufen 9 , 10 zu quantifizieren. Allerdings erfordert die HPLC-Analyse eine genomische DNA-Verdauung. Darüber hinaus sind fortgeschrittene und teure experimentelle Instrumente erforderlich. Daher sind neben den hohen Kosten diese experimentellen Verfahren zeitgenauUming Anti-5-mC-Antikörper sind mittlerweile kommerziell verfügbar, was die Möglichkeit zur Immun-Blotting von 5-mC-haltiger genomischer DNA aus komplexen Genomen geschaffen hat.
In diesem Bericht haben wir genomische DNA aus Chondrozyten extrahiert, die in einer Reihe von Monolayer-Kulturen angebaut wurden. Wir verwendeten einen Dot-Blot-Assay, um den 5-mC-Gehalt in menschlichen Chondrozyten mit einer unterschiedlichen Anzahl von Passagen zu bewerten. Wir fanden, dass der 5-mC-Gehalt in hochdifferenzierten Chondrozyten im Vergleich zu Chondrozyten mit geringer Diffifferenzierung erhöht wurde. Darüber hinaus haben wir eine Beziehung zwischen Dedifferenzierungsstatus und 5-mC-Pegeln identifiziert. Schließlich berichteten wir, dass die Veränderungen im 5-mC-Gehalt mit dem Chondrozyten-Phänotyp assoziiert waren. Daher ist der 5-mC-Punkt-Blot-Assay ein zuverlässiges, einfaches und schnelles Verfahren, um das DNA-Methylierungsniveau in Chondrozyten zu detektieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro beeinträchtigt das Ergebnis von ACI bei der Behandlung der Knorpeldefektreparatur 11 , 12 . Um das ACI-Ergebnis zu optimieren, ist es entscheidend, die Verwendung von dedifferenzierten Chondrozyten zu vermeiden 13 . Studien haben vorgeschlagen, dass das allgemeine DNA-Methylierungsniveau mit dem Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung 4 , <sup class="x…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Naturwissenschaftliche Stiftung von China (Nr. 81572198, Nr. 81260161, Nr. 81000460); Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. 2015A030313772); China Postdoktoranden-Stiftung gefördertes Projekt (Nr. 2013M530385); Die medizinische Forschungsstiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschafts- und Technologieprojekte (Nr. JCYJ20160301111338144, Nr. JSGG20151030140325149, Nr. JSGG20140519105550503; Nr. GJHZ20130412153906739; Nr. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referenzen
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
