We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.
Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.
To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.
However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.
Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.
El protocolo descrito se describe la clonación de genes de interés en el vector de LAP-etiquetado, la generación de líneas celulares estables LAP-etiquetados inducibles, y la purificación de complejos de proteínas LAP-etiquetado para análisis proteómicos. Con respecto a otros enfoques LAP / TAP-etiquetado, este protocolo se ha simplificado para que sea compatible con enfoques de alto rendimiento para trazar un mapa de localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína dentro de cualquier vía celular. Este enfoque ha sido ampliamente aplicado a la caracterización funcional de proteínas críticas para la progresión del ciclo celular, el montaje de huso mitótico, homeostasis polo del huso, y ciliogenesis para nombrar unos pocos, y ha ayudado a la comprensión de cómo misregulation de estas proteínas puede conducir a enfermedades humanas 15, 16,19,20. Por ejemplo, nuestro grupo recientemente utilizado este sistema para definir la función y regulación de la quinesina mitótica STARD9 (un blanco cáncer candidato) en el conjunto del husillo 15,21, para definir unanuevo enlace molecular entre la cadena ligera de dineína Tctex1d2 y cortas síndromes costilla polidactilia (SRPS) 19, y para definir un nuevo vínculo molecular para entender cómo la mutación de la ubiquitina ligasa Mid2 puede llevar a la discapacidad intelectual ligados al cromosoma X 16. Otros laboratorios también han aplicado con éxito este método, incluyendo uno que determina que Tctn1, un regulador de la señalización de Hedgehog ratón, era una parte de un complejo de proteínas ciliopathy asociada a que la composición de membrana ciliar regulado y ciliogenesis de una manera dependiente de tejido 22,23. Por lo tanto, este protocolo se puede aplicar ampliamente a la disección de cualquier vía celular.
Un paso crítico en este protocolo es la selección de líneas celulares estables LAP-etiquetado que son resistentes a higromicina. Se debe tener especial cuidado para asegurar que todas las células de la placa de control están muertos antes de seleccionar focos en la placa experimental para la amplificación. Higromicina también se puede Added durante el cultivo celular rutinario de líneas celulares estables LAP-etiquetado para garantizar además que todas las células mantienen el gen LAP-etiquetado de interés en el sitio de FRT. Advertimos que no todas las proteínas LAP-etiquetados serán funcionales y que es importante disponer de ensayos en el lugar que se pueden utilizar para probar la función de la proteína. Los ejemplos de ensayos usados para poner a prueba la función de proteínas incluyen el rescate de fenotipos siRNA inducida y en ensayos de actividad in vitro. Para hacer frente a cualquier problema potencial con la adición de una gran LAP-tag, hemos generado anteriormente vectores TAP-tag compatibles con este sistema que contiene las etiquetas más pequeñas, como FLAG, que son menos propensos a inhibir la función y localización de la proteína de interés 4. Además, existen vectores de LAP-etiquetado para generar proteínas LAP-etiquetados C-terminal o proteínas TAP-etiquetados C-terminales que son compatibles con este sistema, que puede ser utilizado en los casos en que una etiqueta LAP / TAP no se tolera en el extremo N -terminal de una proteína. Además, THe sal y detergentes concentraciones de los tampones de purificación (LAPX N) se pueden modificar para aumentar o disminuir el rigor de purificación si se observa ninguno o demasiado muchas interacciones. Del mismo modo, el tándem procedimiento de purificación por afinidad es más estricto que los procedimientos de purificación y interactores débiles solo se pueden perder, por tanto, un esquema de purificación solo se puede utilizar cuando se identifican pocos o ningún interactores.
Es importante tener en cuenta que existen otros enfoques GFP epítopo de marcado que permiten la proteína GFP gran escala de marcado para localización y purificación de proteínas estudios 24,25. Estos incluyen el enfoque BAC Transgenomics que utiliza cromosomas artificiales bacterianos para expresar genes GFP-etiquetados de interés de su entorno nativo que contiene todos los elementos reguladores, que imita la expresión de genes endógenos 24. Más recientemente, CAS9 / RNA-guiado individual (sgRNA) complejos de ribonucleoproteína (RNPs) se han utilizado para terminarexógenamente etiquetar los genes de interés con un sistema split-GFP que permite la expresión de los genes GFP-etiquetados de sus loci genómica endógena 25. Aunque ambos enfoques permiten la expresión de proteínas etiquetadas en condiciones endógenas, en comparación con el protocolo LAP-etiquetado descrito aquí, que no permiten la expresión inducible y sintonizable de los genes en la categoría de interés. Además, todavía tienen que aplicarse a epítopo etiquetado tándem de TAP. También es importante tener en cuenta que otros sistemas de marcado también se pueden modificar para ser compatible con el sistema descrito aquí para la generación de líneas celulares estables epítopo de etiquetado inducibles. Por ejemplo, la identificación de proximidad biotina-dependiente (BioID) ha ganado considerable atención debido a su capacidad para definir las relaciones espaciales y temporales entre las proteínas que interaccionan 26. Esta técnica explota fusiones de proteínas a una cepa promiscua de la Escherichia coli biotina ligasa BirA, que biotinilars cualquier proteína dentro de un radio de ~ 10 nm de la enzima. Las proteínas con biotina son luego purificado por afinidad usando captura de biotina-afinidad y se analizó la composición por espectrometría de masas. BirA se biotinilar cualquier proteína en estrecha proximidad, incluso de forma transitoria, que hace que sea especialmente adecuado para la detección de débiles socios que interactúan dentro de un complejo 27. Además, el esquema de purificación no requiere que las interacciones proteína-proteína endógenos permanecen intactos y pueden llevarse a cabo bajo condiciones de desnaturalización, reduciendo así la tasa de falsos positivos. Dentro de nuestro protocolo actual, la sustitución del vector pGLAP1 por un vector BirA-etiquetado podría transformar este sistema desde la identificación de las interacciones proteína-proteína en base a la afinidad a la detección de ellos basado en la proximidad. un sistema de este tipo sería muy ventajoso para la detección de interacciones proteína transitorios como es el caso entre muchas interacciones enzima-sustrato y para mapear el inte proteína-proteína espacio-temporalracciones dentro de las estructuras definidas como se ha llevado a cabo para el centrosoma y los cilios 26,28.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
PETG, 5X | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
PETG, 2.5X | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
500 mL conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
4X Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |