タンパク質機能を調べるための誘導LAP-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク

注：目的の任意のタンパク質のための誘導可能なLAPタグ安定な細胞株の生成の概要を図1に示され、LAPタグ化タンパク質の発現、精製及び質量プロテオミクスのための準備の概要を、図3に示されている分析します。 1. LAPタグベクターに目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）のクローニングシャトルベクターに目的の遺伝子のORFのクローニング。 N末端融合またはC末端融合のいずれかのためのプライマー内の適切にattB1およびattB2部位と関心のあるORFを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用します。 PCR条件のためのプライマー配列および表2は、 表1を参照してください。 ゲルは、1％アガロースゲル上で、それらを解決することにより、PCR産物を精製します。ゲルから正しいサイズである増幅バンドを切除し、DNAグラムを使用して、ゲルスライスから抽出製造元の指示に従って、エル抽出キット。 シャトルベクターを含むattP部位とPCR産物は、製造業者の指示に従ってベクターに再結合することを可能にするリコンビナーゼでPCR産物を含む精製するattBをインキュベート（Mのaterialsの表を参照してください）。 注：空のシャトルベクターとLAP-タグ付けベクトルは（ 材料表を参照） のccd B遺伝子が含まれているとCCD B耐性細菌細胞内で増殖しなければなりません。 ORFは、これらのベクターに挿入されたときしかし、ccdB遺伝子は、クローニングされたORFでベクターを増殖させる場合、したがって、標準的なDH5α 大腸菌細胞を使用して再結合されます。 反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および50mg / mlのカナマイシン13をルリアブロス（LB）寒天プレート上で形質転換細胞をプレート。 カナマイシン耐性コロニーを選択します。 LB私の中で選択したコロニーを育てます50 mg / mlでカナマイシンをDIAは、DNAミニプレップを行い、 表3に記載の配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の組込みを確認します。 LAP-タグVectorにシャトルベクターから目的の遺伝子を転送します。 LAP-タグベクター（N末端融合のためのpGLAP1）とに従ってLAP-タグベクターにシャトルベクターから目的の遺伝子の転送を媒介するリコンビナーゼで関心のORFの配列を検証遺伝子を含むシャトルベクターをインキュベート製造業者の説明書（材料を参照されたいです）。 注記：所望のプロモーター、エピトープタグに基づいて使用することができるLAP / TAPベクターシリーズ、NまたはC末端タグを表4に見出すことができます。 反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および100mg / mlアンピシリン13をLB寒天プレート上に形質転換された細胞をプレート。 アンピシリン耐性結腸を選択NIES。 100mg / mlのアンピシリンを含むLB培地中で選択したコロニーの成長、DNAミニプレップを行い、 表5に記載されている配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の統合を確認します。 関心のLAP-タグ付けされた遺伝子を発現誘導する安定な細胞株の2世代興味のあるプロジェクトに最も適した細胞株を選択します。あるいは、構成のTetRを発現し、（材料を参照）関心のLAPタグ遺伝子が安定的にゲノムに組み込まれることを可能にするFRT部位を含む任意の既存の細胞株からの宿主細胞株を作成します。 注：このプロトコルのTetRとFRT部位を含むHEK293細胞株を使用して、[テトラサイクリン（-tet）を欠いている、10％ウシ胎児血清（FBS）で作ら] -tet DMEM / F12培地中で成長させた4 。 1〜2おしっこ内の宿主細胞株を殺すために必要なハイグロマイシンの最小濃度を決定薬剤添加後のKS。濃度は、大部分は、100μg/ mlの800μgの/ mlの間の範囲で、宿主細胞株の間で変化することができます。 注：37℃、5％CO 2が 1〜2週間以内に死亡するで100μg/ mlのハイグロマイシンで-tet DMEM / F12培地中で増殖させたHEK293細胞。 製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてHEK293細胞にLAPタグ付きベクターで（細胞のゲノム内のFRT部位への関心のLAP-タグ付けされた遺伝子の組込みを媒介）フリッパーゼリコンビナーゼを発現するベクターを同時トランスフェクト。 LAPベクトル14にリコンビナーゼベクトルの1：4の比率を使用してください。 注：最適な比率は、トランスフェクションの宿主細胞株および方法に依存し、滴定を必要とするかもしれません。 4：1の比率は、ほとんどの細胞株に適しています。ネガティブコントロールとしてモックトランスフェクションプレートが含まれます。 ある日、トランスフェクション後、新鮮な培地で-tet DMEM / F12培地を交換してください。 二日後transfectiで、25％コンフルエンスに細胞を分割します。 〜5時間、細胞がステップ2.2で所定の濃度でハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を追加し、添付することができます。 HEK293ために、細胞を、100μg/ mlのハイグロマイシンを使用します。 注：HEK293細胞株を含むFRTはまた、ブラストサイジン耐性と関連付けられているのTetRを含有するので、5μg/ mlのブラストサイジンをのTetRを選択し、漏出性発現を最小限にするために、安定な細胞株の選択プロセス中に使用されます。 必要に応じて、異なる細胞巣はそれが透明板に対して不透明なスポットに似て表示されるまでハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を交換してください。 各セルの巣の上にトリプシンの20μlを添加して、200μlのピペットチップでダウン2回をピペットと。 24ウェルプレートに入れ細胞およびハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地中で継続的な成長によって細胞を拡大。 固定細胞または生細胞蛍光顕微鏡によって誘導LAPタグ化タンパク質の発現のための画面細胞及び/又はLAP-タグ15内の GFPタグのウェスタンブロッティング。 LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の3精製注：次のLAP-タグ付きタンパク質精製プロトコルは、以前の経験に基づいて、典型的なLAP-タグ付きタンパク質精製のために用いられる条件とボリューム上の推奨事項を詳しく説明します。しかし、注意が経験的な最適化は、任意のタンパク質複合体と最良の結果を提供するために、関心対象のタンパク質の発現レベルについて行われることを確実にするために行使されるべきです。 細胞増殖および細胞収穫。 継続的に37℃、5％CO 2で-tet DMEM / F12培地中でより大きなプレートおよび/またはローラーボトルの中にすべてのHEK293細胞を継代することにより、タンパク質複合体のTAP分離のための検証LAP-タグ付けされた細胞株を展開します。 テト/ Doxの誘導性の細胞株について、harvestin前に、0.2 / mlのテト/ Doxの細胞が到達〜70％の密集度の濃度で10〜15時間誘導G細胞。 注：濃度と誘導時間は、各タンパク質について決定されるべきである、10〜15時間、0.1〜1 / mlのテト/のDoxの滴定を推奨します。 5-10分間、875×gで攪拌またはトリプシン処理し、細胞をペレット化することにより細胞を回収します。 プロテインAビーズを抗GFP抗体を結合 0.5ミリリットルの細胞ペレット、充填細胞容積（PCV）から調製した溶解物から免疫沈降に抗体40μgのを使用してください。 注：必要な抗体の量は、他の要因の中でも特に、LAP-タグ付けされたタンパク質の量に依存し、最適化が必要になります。 10-40μgのの滴定を推奨します。 1.5mlチューブにPBST（PBS + 0.1％のTween-20）中に160μlのパックされた体積（PV）プロテインAビーズを平衡化。 PBST 1mlで3回洗浄します。 注：本明細書中のすべての洗浄は、10秒間5,000×gで、ビーズを遠心分離することによって行われます。 再懸濁ビーズを500μlのPBST中との親和性の80μgのを追加します。160μlのビーズを各チューブに-purifiedウサギ抗GFP抗体。室温（RT）で1時間混合します。 PBST 1mlでビーズを2回洗浄します。その後、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9（20 mlの0.2 Mホウ酸ナトリウム+ 15 mlの0.2 Mホウ酸）の1mlでビーズを2回洗浄します。最終洗浄後、1ミリリットルに最終容量をもたらすために、0.2Mホウ酸ナトリウム900μlの、pHが9を追加します。 最終濃度20mMに220ミリモルのジメチルピ（DMP）の100μLを加えます。室温で30分間穏やかにチューブを回転させます。 220 mMのDMPは、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9の877μlの1 50mgのボトルの内容物を再懸濁し、ビーズ懸濁液にすぐに追加します。 DMPとのインキュベーションの後、残留架橋剤を不活性化するために、0.2Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の1mlでビーズを1時間を洗います。同じ緩衝液1ml中に再懸濁ビーズ、室温で1時間回転させます。ペレットビーズおよび0.2 Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の500μlの中に再懸濁ビーズ。ビーズはSeveraのために安定しています4℃でリットルヶ月。 細胞溶解および複雑な精製のための緩衝液の調製 pH7.4の溶液を製造することにより、（タンパク質を溶出する前に洗濯ビーズのための最もビーズの洗浄のための細胞溶解のための300ミリメートル、200ミリメートル、100ミリメートル×は、所望の塩濃度であるLAPバッファの[のKCl]）LAPXバッファを準備します50mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、XのKCl、1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、1mMのMgCl 2、及び10％グリセロールを含みます。 注：このバッファの構成要素は、生細胞環境を近似するために使用されます。 HEPESは、7.2から8.2のpH怒りのバッファとして使用されています。 KClを緩衝液のイオン強度を維持するために使用される塩です。 EGTAは、マグネシウムに比べてカルシウムのレベルを減少させるためにカルシウムイオンを結合するキレート剤です。グリセロールおよびMgCl 2は、タンパク質の安定性を改善するために使用されます。 0.05％ノニルphenoxypolを追加することによってLAPX Nバッファを準備LAPXバッファへyethoxylethanol。 注：ノニルphenoxypolyethoxylethanolは、タンパク質を可溶化、中性洗剤であるが、より高い濃度が、抽出プロセス中に使用されるタンパク質 – タンパク質相互作用を維持し、それが次に、結合及び洗浄の工程の間に低下します。 細胞溶解物の調製 0.5 mMのジチオスレイトール（DTT）およびプロテアーゼ阻害剤とLAP300の2.5ミリリットルにPCVを500μlを再懸濁します。 10％のノニルphenoxypolyethoxylethanol（最終0.3％）の90μlを添加して、反転により混合します。 10分間氷上に置きます。 10分間、21,000×gで遠心分離します。この低速上清（LSS）を収集します。ゲル分析のためのLSSの10μlのサンプルを取ります。 4℃で1時間、100,000×gでTLA100.3管とスピンにLSSを転送します。チューブに、この高速上清（HSS）を収集し、氷上に置きます。ゲル分析のためにHSSの10μlのサンプルを取ります。 注：一番上の脂質層ANを服用しないでくださいDボトムほとんどの細胞破片層。脂質層は、HSSを収集する前に、真空吸引によって除去されるべきです。 第1の親和性キャプチャ：抗GFPビーズへの結合プレ溶出抗体結合されたビーズは、非結合を取り除くために、溶出緩衝液[20 mMトリス、pHが7.4と3.5 MのMgCl 2]の1ミリリットルでそれらを3回洗浄することにより（0.5ミリリットル細胞ペレット（PCV）あたりのビーズの160μlのを使用します）抗体とは、バックグラウンドを低減します。迅速に行います。長時間の高塩中のビーズを放置しないでください。 LAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 HSSは、4℃で1時間、抗体ビーズを用いて抽出し混合します。 10分間、21,000×gで遠心分離します。上清の10μlのサンプルを取る（ すなわち 、（FT）を流れる）ゲル分析のために。 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを2回（各5分）洗浄します。すぐに2トンを洗いますタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼを加える前に0.5 mMのDTTなしプロテアーゼ阻害剤とLAP200 Nの1ミリリットルでのIME。 TEV切断 LAP200 Nの1ミリリットル中に10μgのTEVプロテアーゼを希釈し、4℃で一晩チューブを回転させます。 注：このステップは、LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の維持を助けることができるTEVプロテアーゼの濃度を調整することにより、数時間で完了すべきLAPタグタンパク質のために最適化することができます。 新しいチューブへのペレット、ビーズおよび転送上清。任意の残留タンパク質を除去するために、160μlの0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とのLAP200 N（トリプル濃度）で2回ビーズを洗浄します。ゲル分析のために上清の10μlのサンプルを取ります。 第二に親和性のキャプチャ：Sプロテインアガロースへの結合 80μlのSタンパク質アガローススラリーの1チューブ（40μlを充填した樹脂）LAP200 Nの1ミリリットルで3回洗浄します。 注：S PROTEINがアクティブのRNaseを再構成しますS-タグに結合し、代替第二のエピトープタグは、RNAを含むタンパク質複合体のために考慮されるべきです。 TEVを追加Sタンパク質アガロースビーズと4℃で3時間、岩に上清を溶出しました。ペレット、ビーズおよび0.5mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlで3回洗浄します。 LAP100 1mlでビーズを2回洗浄します。 タンパク質溶出 10分間97℃で4×Laemmliサンプル緩衝液と熱の50μLを添加することによって、アガロースSタンパク質をタンパク質をオフ溶出。 注記：タンパク質は、溶出緩衝液（20mMのTris、pH7.4で3.5 MのMgCl 2）を用いてビーズから溶出することができます。 4.質量分析によって相互作用するタンパク質を同定参照（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、銀染色ゲルにより収集されたサンプルを分析することによって、精製の品質をテストします<stronグラム>材料表）および溶出液を免疫ブロット法およびLAPタグ付き精製が16を働いたことを確認するために、抗GFP抗体でプロービングすることにより、 図4を参照してください。 化学量論的および準化学量論的同時精製の種を同定するために、最終的な溶出サンプルを採取し、SDS-PAGEによってそれを分けます。質量分析互換性のタンパク質染色でゲルを染色。最も顕著なバンドやゲルからそれらの間にスペースを切除し、質量分析別途16による分析のためにそれらを処理します。 注：最終精製の溶出液を分離し、質量分析5のためにそれらを調製するための多くのアプローチがあります。例えば、LAP精製複合体は、高塩（3.5 MのMgCl 2）を使用して、Sタンパク質のビーズから溶出することができ、ひとまとめ全タンパク質集団は、質量分析17によって分析することができます。あるいは、最後の溶出液を1 SDS-PAGEによるミリおよびeできる単一の1ミリバンドのために分離することができますxcisedと分析しました。これは、分析を妨害する任意のビーズまたは粒子状物質の複雑な混合物をクリアします。