Inductibles stables lignées cellulaires LAP marqués pour Enquêter la fonction des protéines, Spatiotemporal Localisation et Interaction Networks Protein

NOTE: Une vue d' ensemble de la génération de lignées cellulaires stables inductibles LAP marqués pour toute protéine d'intérêt est illustrée à la figure 1 et la vue d' ensemble de l' expression de la protéine LAP-tagged, la purification et la préparation de protéomique de masse analyses est illustrée à la figure 3. 1. Clonage du cadre de lecture ouvert (ORF) du gène d'intérêt dans le LAP-tag Vector Clonage de l'ORF du gène d'intérêt dans la navette Vector. Utiliser la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier l'ORF d'intérêt avec les attB1 et attB2 des sites appropriés dans les amorces pour l'une ou l'autre fusion N-terminale ou une fusion C-terminale. Voir le tableau 1 pour les séquences d'amorces et le tableau 2 pour les conditions de PCR. Gel purifie les produits PCR par leur résolution sur un gel d'agarose à 1%. Exciser la bande amplifiée qui est la taille correcte du gel et l'extraire de la tranche de gel en utilisant un ADN gkit d'extraction el selon les instructions du fabricant. Incuber le attB purifié contenant des produits de PCR avec un attP contenant le vecteur navette et la recombinase qui permet aux produits de PCR se recombiner dans le vecteur selon les instructions du fabricant (voir M atières Table). NOTE: Les vecteurs navettes vides et LAP-marquage vecteurs contiennent le gène ccd B et doivent être propagé dans des cellules bactériennes résistantes ccd B (voir tableau des matériaux). Toutefois , le gène ccdB est recombinée quand un ORF est inséré dans ces vecteurs, donc utiliser des cellules standard DH5a de E. coli lors de la propagation des vecteurs avec des ORFs clonées. Transformer des cellules DH5a de E. coli avec 1 pl du produit de la réaction et de la plaque les cellules transformées sur un bouillon de Luria (LB) gélose avec 50 mg / ml de kanamycine 13. Sélectionnez les colonies résistantes à la kanamycine. Cultivez les colonies sélectionnées dans LB-moide diamètre avec 50 mg / ml de kanamycine, faire une mini-préparation d'ADN et confirmer l' intégration du gène par un séquençage d'ADN en utilisant les amorces de séquençage énumérées dans le tableau 3. Transfert du gène d'intérêt de la navette du vecteur dans le LAP-tag Vector. Incuber le vecteur navette contenant le gène de la séquence vérifiée d'intérêt ORF avec le vecteur LAP-tag (pGLAP1 pour la fusion N-terminal) et la recombinase qui médie le transfert du gène d'intérêt du vecteur navette dans le vecteur LAP-tag selon les instructions du fabricant (voir Matériaux). NOTE: Une série de vecteurs LAP / TAP qui peuvent être utilisés en fonction du promoteur désiré, épitope-étiquette, et N ou le marquage C-terminal peuvent être trouvés dans le tableau 4. Transformer des cellules DH5a de E. coli avec 1 pl du produit de la réaction et de la plaque les cellules transformées sur une plaque d'agar LB contenant 100 mg / ml 13 d' ampicilline. Sélectionnez la colo résistant à l'ampicillineNEI. Cultivez les colonies sélectionnées dans un milieu LB avec 100 mg / ml ampicilline, faire une mini-préparation d' ADN, et de confirmer l' intégration du gène par séquençage d'ADN en utilisant les amorces de séquençage énumérées dans le tableau 5. 2. Génération d'un inductible cellulaire Stable ligne qui exprime le gène LAP-étiqueté d'intérêt Sélectionnez la ligne qui convient le mieux pour le projet d'intérêt de la cellule. En variante, créer une lignée de cellules d'hôte à partir d'une quelconque lignée cellulaire existant qui exprime de manière constitutive le TetR et contient un site FRT qui permet au gène LAP marqués d'intérêt devant être intégré de manière stable dans le génome (voir Matériaux). Remarque: Ce protocole utilise une lignée de cellules HEK293 qui contient le TetR et un site FRT, qui est cultivé dans -tet DMEM / F12 [faite avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) qui est dépourvu de tetracycline (-tet)] 4 . Déterminer la concentration minimale de hygromycine nécessaire pour tuer la lignée cellulaire hôte en 1 à 2 weeks après addition de la drogue. La concentration peut varier entre les lignées de cellules hôtes, la majorité se situant entre 100 pg / ml et 800 pg / ml. NOTE: les cellules HEK293 cultivées dans -tet DMEM / F12 avec 100 pg / ml d' hygromycine à 37 ° C et 5% de CO 2 va mourir dans les 1-2 semaines. Co-transfecter le vecteur qui exprime la recombinase flippase (médie l'intégration du gène LAP étiquetée d'intérêt dans le site FRT dans le génome de la cellule) avec le vecteur LAP étiqueté dans des cellules HEK293 en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant . Utiliser un ratio de 4: 1 du vecteur de recombinase à vecteur LAP 14. NOTE: Le rapport optimal dépend de la lignée cellulaire hôte et le procédé de transfection, et peut nécessiter un titrage. Un rapport de 4: 1 fonctionne bien pour la plupart des lignées cellulaires. Inclure une plaque maquette transfectées comme témoin négatif. Un jour après la transfection, remplacer le support / F12 -tet DMEM avec des milieux frais. Deux jours après transfectile fractionnement de cellules, à 25% de confluence. Laisser les cellules ~ 5 h à attacher, puis ajouter hygromycine contenant -tet DMEM / F12 à la concentration prédéterminée dans l'étape 2.2. Pour HEK293 cellules utilisent 100 pg / ml d'hygromycine. REMARQUE: Le TRAF contenant une lignée cellulaire HEK293 contient également le TetR qui est associée à la résistance à la blasticidine, par conséquent, 5 ug / ml de blasticidine est utilisé pendant le processus de sélection de lignées cellulaires stables pour choisir le TetR et pour minimiser l'expression qui fuit. Remplacer hygromycine contenant -tet DMEM / F12 selon les besoins jusqu'à ce que des foyers de cellules distinctes apparaissent qui ressemblent à des taches opaques contre la plaque transparente. Ajouter 20 pi de trypsine au-dessus de chacun des foyers de cellules et de haut en bas pipeter 2 fois avec une pointe de pipette de 200 pi. La place des cellules dans une plaque 24 puits et étendre les cellules par une croissance continue dans hygromycine contenant -tet DMEM / F12. cellules d'écran pour inductible expression de la protéine LAP marqués par cellule fixe ou des cellules vivantes de microscopie par fluorescence et / ouWestern blot pour la balise GFP dans le LAP-tag 15. 3. Purification des complexes de protéines LAP-tagged NOTE: Les LAP-tagged purification de protéines détails protocolaires recommandations suivantes sur les conditions et les volumes utilisés pour une protéine purification typique LAP-tagged basé sur l'expérience précédente. Cependant, il faut être prudent pour veiller à ce que l'optimisation empirique est effectuée pour tout niveau d'intérêt expression complexe de protéines et de protéines pour fournir les meilleurs résultats. La croissance cellulaire et la cellule de récolte. Développez la lignée cellulaire LAP-tagged validé pour l' isolement du TAP de complexes protéiques, par passage en permanence toutes les cellules HEK293 dans des plaques plus grandes et / ou des bouteilles à rouleaux dans -tet DMEM / F12 à 37 ° C et 5% de CO 2. Pour les souris Tet / Dox lignées cellulaires inductibles, pour induire de 10 à 15 heures à une concentration de 0,2 pg / ml Tet / Dox lorsque les cellules ont atteint ~ 70% de confluence avant harvesting de cellules. NOTE: Le temps de concentration et de l'induction doit être déterminé pour chaque protéine, un titrage de 0,1-1 pg / ml Tet / Dox pendant 10-15 heures est recommandé. Récolte des cellules par agitation ou trypsinisation et pellets cellules à 875 g pendant 5-10 min. Accouplement anti-GFP anticorps à des billes de protéine A Utilisez 40 ug d'anticorps pour l'immunoprécipitation d'un lysat préparé à partir d'une pastille de 0,5 ml de cellules, hématocrite (PCV). NOTE: La quantité d'anticorps nécessaire dépendra de l'abondance de la protéine LAP-marqué, entre autres facteurs, et nécessitera l'optimisation. Un titrage de 10 à 40 pg est recommandée. Equilibrer 160 ul de volume compressé (PV) des billes de protéine A dans du PBST (PBS + 0,1% de Tween-20) dans un tube de 1,5 ml. Laver 3 fois avec 1 ml de PBST. NOTE: Tous les lavages des présentes sont réalisées par centrifugation des perles à 5000 xg pendant 10 sec. Remettre les billes dans 500 pi PBST et ajouter 80 pg d'affinitélapin anti-GFP purifié à anticorps à chaque tube de 160 perles ul. Mélanger pendant 1 heure à la température ambiante (RT). Laver les billes 2 fois avec 1 ml de PBST. Ensuite, les perles de lavage 2 fois avec 1 ml de 0,2 M de borate de sodium, pH 9 (20 ml 0,2 M borate de sodium + 15 ml de 0,2 M d'acide borique). Après le lavage final, ajouter 900 pi de borate de sodium 0,2 M, pH 9 pour amener le volume final à 1 ml. Ajouter 100 ul de 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) à une concentration finale de 20 mM. Tournez doucement les tubes à température ambiante pendant 30 min. Pour mM DMP 220, resuspendre contenu d'un flacon de 50 mg dans 877 ul de 0,2 M borate de sodium, pH 9 et ajouter immédiatement à la suspension de billes. Après incubation avec le DMP, laver les perles 1 fois avec 1 ml de 0,2 M d'éthanolamine, 0,2 M de NaCl, pH 8,5 pour inactiver l'agent de reticulation résiduel. Resuspendre les billes dans 1 ml du même tampon et tournent pendant 1 heure à température ambiante. perles de granules et de perles de remettre en suspension dans 500 ul de 0,2 M éthanolamine, 0,2 M de NaCl pH 8,5. Perles sont stables pour several mois à 4 ° C. Préparation de tampons pour Lyse des cellules et purification du complexe Préparation des tampons LAPX (où X est la concentration en sel désirée [KCI mM] du tampon LAP; 300 mM pour la lyse des cellules, 200 mM pour la plupart des lavages de talon, et 100 mM pour les billes de lavage des protéines avant l'élution) en faisant un 7,4 solution à pH contenant mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-50 piperazineethanesulfonic (HEPES), X mM de KCl, 1 mM d' acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA) 1 mM de MgCl2 et 10% de glycérol. REMARQUE: Les composants de ce tampon sont utilisés pour rapprocher l'environnement dans les cellules vivantes. HEPES est utilisé comme un tampon dans la rage de pH de 7,2-8,2. KCI est un sel utilisé pour maintenir la force ionique du tampon. EGTA est un agent chélatant qui lie les ions calcium pour réduire les niveaux de calcium par rapport au magnésium. Le glycérol et MgCl2 sont utilisés pour améliorer la stabilité des protéines. Préparer tampon LAPX N en ajoutant 0,05% nonyle phenoxypolyethoxylethanol au tampon de LAPX. REMARQUE: nonyl phenoxypolyethoxylethanol est un détergent qui solubilise les protéines, mais préserve les interactions protéine-protéine, ainsi une concentration plus élevée est utilisée pendant le processus d'extraction et il est ensuite abaissée au cours des étapes de liaison et de lavage. Préparation des lysats cellulaires Remettre en suspension 500 pi de CVP dans 2,5 ml de LAP300 avec du dithiothréitol 0,5 mM (DTT) et les inhibiteurs de protéase. Ajouter 90 ul de 10% nonyle phenoxypolyethoxylethanol (0,3% final) et mélanger par retournement. Placer sur la glace pendant 10 min. Centrifugeuse à 21.000 xg pendant 10 min. Recueillir ce surnageant à faible vitesse (LSS). Prélever un échantillon de 10 ul du LSS pour l'analyse sur gel. Transfert LSS à un tube de TLA100.3 et de spin à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Recueillir ce surnageant à grande vitesse (HSS), dans un tube et le placer sur la glace. Prélever un échantillon de 10 pi de la SSC pour l'analyse sur gel. REMARQUE: Évitez de prendre le plus haut sommet lipidique couche d'und de la couche inférieure la plus débris cellulaires. La couche lipidique doit être éliminé par aspiration sous vide avant de recueillir le HSS. Première capture d'affinité: Reliure à Perles Anti-GFP Pré-éluées des billes d'anticorps couplés (utilisent 160 ul de perles par 0,5 ml de culot cellulaire (PCV)) en les lavant 3 fois avec 1 ml de tampon d' élution [3,5 M de MgCl2 à 20 mM de Tris, pH 7,4] pour se débarrasser de découplée anticorps et réduisent fond. Faites vite. Ne laissez pas des perles en sel élevée pendant une longue période. Laver les billes 3 fois avec 1 ml de N LAP200. Mélanger HSS extrait avec des billes d'anticorps pendant 1 heure à 4 ° C. Centrifugeuse à 21.000 xg pendant 10 min. Prélever un échantillon de 10 ul du surnageant ( par exemple, le débit (FT)) pour une analyse sur gel. Lavez perles 3 fois avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Lavez perles 2 fois (5 min chacun) avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Laver rapidement 2 times avec 1 ml de N LAP200 avec 0,5 mM de DTT et sans inhibiteurs de protéase avant d' ajouter la protéase du virus etch du tabac (TEV). TEV Décolleté Diluer 10 ug protéase TEV dans 1 ml de N LAP200 et faire tourner les tubes à 4 ° C pendant une nuit. REMARQUE: Cette étape peut être optimisée pour toute protéine LAP-étiqueté à être complété en quelques heures en ajustant la concentration de la protéase TEV, qui peut aider à la préservation des complexes de protéines LAP-tagged. perles à granulés et le transfert surnageant à un nouveau tube. Rincer perles deux fois avec 160 ul LAP200 N avec 0,5 mM de DTT et les inhibiteurs de la protéase (concentration triple) pour éliminer toute protéine résiduelle. Prélever un échantillon de 10 ul du surnageant pour l'analyse sur gel. Deuxième Capture d'affinité: Reliure à S Protein Agarose Laver 1 tube de 80 ul de protéine S agarose suspension (40 pi de résine emballé) 3 fois avec 1 ml de N LAP200. REMARQUE: S protliaison ein à l'étiquette S va reconstituer une RNase active et une deuxième étiquette d'épitope alternatif doit être pris en considération pour l'ARN contenant des complexes protéiques. Ajouter TEV élue surnageant à S billes de protéine d'agarose et de roche pendant 3 heures à 4 ° C. Perles de granules et laver 3 fois avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Laver les billes 2 fois avec 1 ml de LAP100. On élue la protéine Éluer des protéines de la protéine S d'agarose en ajoutant 50 pi de Laemmli 4x tampon d'échantillon et on chauffe à 97 ° C pendant 10 min. REMARQUE: Les protéines peuvent être éluées à partir des billes avec du tampon d'élution (3,5 M de MgCl2 à 20 mM de Tris, pH 7,4). 4. Identifier les protéines interagissant par analyse de spectrométrie de masse Tester la qualité de la purification par l'analyse des échantillons prélevés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), coloration à l'argent du gel (voir <strong> Matériaux de table) et par immunotransfert éluats et le sondage avec des anticorps anti-GFP pour faire en sorte que la purification LAP-tagged travaillé 16, voir la figure 4. Pour identifier les espèces co-purifiantes stoechiométriques et stoechiométriques, prélever l'échantillon final d'élution et le séparer par SDS-PAGE. Colorer le gel avec une spectrométrie de masse de protéines compatible tache. Exciser les groupes les plus importants et l'espace entre eux à partir du gel et de les traiter pour l' analyse par spectrométrie de masse séparément 16. NOTE: Il existe de nombreuses approches pour séparer les éluats finales de purification et de les préparer à la spectrométrie de masse 5. Par exemple, les complexes LAP purifiés peuvent être élues à partir de perles S-protéine en utilisant haute teneur en sel (3,5 M MgCl 2) et l' ensemble de la population de protéines en masse peut être analysé par spectrométrie de masse 17. Alternativement, éluats finaux peuvent être séparés pour 1 mm par SDS-PAGE et une seule bande de 1 mm peut être excised et analysés. Cela efface le mélange complexe de toutes les billes ou les matières particulaires qui interfèrent avec l'analyse.