Summary

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Published: August 19, 2016
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Summary

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduction

Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen 6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 + Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) 5 aufrechterhalten wird, 12. Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur 5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status 3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 niedrig CD11b hoch Ly6b hohe CD206 niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer 3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen.

Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen 1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 + Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 6 Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 + Zellen 1 , 5,12. Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) 1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht.

Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation 4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren 16 wird die Kollagenase – Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren 2 ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn 16 angepasst werden.

Protocol

Alle Protokollschritte durchgeführt wurden von der University of Missouri Animal Care und Use Committee (ACUC) überprüft und genehmigt. Für dieses Protokoll, männlichen C57BL / 6-Mäuse im Alter von 15 Wochen wurden genutzt, obwohl theoretisch jeder Nagetier in jedem Alter kann für Experimente verwendet werden. Da dies ist ein Nicht-Überlebens Operation wird Euthanasie durch Ausbluten und bilaterale Pneumothorax erreicht. 1. Durchblutung der Nieren Hinweis: …

Representative Results

Die Anzahl der Platten, die von der Anzahl der Immunzellen kann ausgeführt abhängt, die aus den Nieren zuverlässig extrahiert werden kann. Hier zeigen wir die Möglichkeit, zwei Platten zu laufen, eine für T-Lymphozyten und eine für Makrophagen / dendritischen Zellen. Auf der T-Lymphozyten – Panel, wir in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Muster und beschreiben die Bevölkerung von Interesse schauen zuerst , wie in Abbildung 1 (oben links Punkt – …

Discussion

Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

Materials

Stomacher 80 Biomaster lab system Seward
Stomacher 80 Classic bags Seward BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Analytical flow cytometer BD LSR-X20 Fortessa
Percoll  Sigma P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) Gibco, Life Technologies 14190-250
Polypropylene tubes, no cap Becton Dickinson 352002
Fixable Viability Stain BD Biosciences  FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93) EBioscience 14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421  BD Pharmingen 103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC EBioscience 17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 Biolegend 135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 Biolegend 103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 Biolegend 100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 Biolegend 100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC Biolegend 127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 Biolegend 101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC Biolegend 123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 Biolegend 117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 Biolegend 145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE Biolegend 137803/4
100 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml Fisher Or equivalent equipment 
Fisherbrand Tubes 15 ml Fisher Or equivalent equipment 
Sucrose Fisher chemical S5-3
Transfer pipette fine tip Samco Scientific 232 Or equivalent equipment 
Flow Cytometery Staining Buffer Solution EBioscience 00-4222-26 Or equivalent equipment 
1X RBC Lysis Buffer EBioscience 00-4333-57 Or equivalent equipment 

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Diesen Artikel zitieren
Nistala, R., Meuth, A., Smith, C., Annayya, A. Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells. J. Vis. Exp. (114), e54368, doi:10.3791/54368 (2016).

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