Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Immuunsysteem activeringssysteem voorkomt in meerdere nierziekten en pathofysiologische processen 6,10,11,13. Potentiële gebieden actief onderzoek omvatten de verschillende triggers voor activering van het immuunsysteem, verschillende celtypen betrokken, het cytokine / chemokine patroon in een bepaalde instelling ziekte modulatie van alle bovengenoemde processen een bepaald geneesmiddel etc. Om illustreren, ischemie-reperfusie verwonding (een model voor acuut nierfalen), er een toename in immune cellen of beenmerg afgeleide hematopoietische cellen of CD45 + cellen binnen enkele uren, die wordt ondersteund door de periode van herstel of fibrose (6 weken later) 5, 12. Deze immuunsysteem cellen scheiden zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokines en chemokines het herstelproces 5,12 orkestreren. Momenteel is de mogelijkheid om meerdere fluoroforen gelijktijdig om celpopulaties label in een enkele celsuspensie toe met de advertentievent van moderne machines met flowcytometrie 04:56 lasers. Dit heeft een aanzienlijke bijdrage aan de mogelijkheid om de celpopulaties op basis van de functionele status 3,7 discrimineren. Bijvoorbeeld, om nauwkeurig te etiketteren een macrofaag als F4 / 80 laag CD11b hoge Ly6b hoge CD206 laag, ten minste 3 meer fluoroforen nodig zou zijn in hetzelfde monster volume gate voor levende cellen, CD45 + (leukocyten) en Ly6G- (neutrofielen) en dit is zeer goed mogelijk met de nieuwere flowcytometers 3. De stroomafwaartse testen voor cytokine secretie, celproliferatie, cytotoxiciteit, macrofaagactivering en kwantificering van aantallen verschillende subsets van lymfocyten en monocyten moet niet alleen goede kwaliteit (levende cellen, singlets) maar voldoende aantallen cellen.
Het immuunsysteem in de nier is opgebouwd uit zowel adaptieve en aangeboren componenten en meerdere celtypen 1,7,13. Bijvoorbeeld, bij muizen de twee kidneys elkaar worden gerapporteerd aan 2-17% bevatten (28,000-266,000) CD45 + cellen van het totale nier immuuncellen geïsoleerd (1,4 x 10 6 cellen) en ongeveer 5-15% (1,400-4,200) van deze CD4 + -cellen 1 , 5,12. Een klein percentage (5-15%, 70-630) van deze CD4 + cellen Foxp3 + cellen (figuur 1) 1. Door deze trapsgewijze verlaging percentages cellen soms celpopulatie (in dit geval CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen) wordt voorgesteld met slechts ~ 100 cellen. Het kleine aantal CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen maakt het noodzakelijk dat een groot aantal totale cellen worden geïsoleerd en de cellen zijn van goede kwaliteit voor downstream studies zoals cytokine secretie assays. Bovendien kan het nodig zijn nieren combineren 2-3 muizen aangezien de subpopulaties niet hoog genoeg getallen worden kwantificeerbare assays. Dus betrouwbare en efficiënte isolatie van nier mononucleaire celpopulaties is wenselijk om study de immunologische spectrum geassocieerd met nierziekten.
Traditioneel, voor het isoleren van mononucleaire cellen nieren, onderzoekers hebben verschillende enzymatische digesties zoals collagenase 1A of II zoals DNase 1 1,5,12 gebruikt. Het is bekend dat collagenasen hebben enzymatische activiteit die varieert met lotnummers en bedrijf van vervaardiging, noodzakelijk titratie de optimale concentratie en de incubatie 4,14,15. Daarnaast digestie met collagenase voegt tijd voor hakken de nier in kleine stukjes, noodzakelijk incubatie van de nier stukken in een verwarmde (37 ° C) bad en extra tijd voor incubatie in EDTA voor het stoppen van de reactie. Bovendien kunnen minder steriliteit worden bereikt voor bepaalde stroomafwaartse procedures nodig celkweek. Belangrijker is afhankelijk van de onderzoeker en alle variabelen betrokken, leidt de variabiliteit van de gegevens en interpretatie in laboratoria. Onlangs heeft deontwikkeling van mechanische weefsel verstoorders / homogenisatoren 16, wordt de collagenase digestie stap volledig worden vermeden en vervangen door een eenvoudige mechanische verbreking van de nieren 2. Hierin tonen we een eenvoudige maar efficiënte methode voor het isoleren van de nier immuuncellen voor dagelijks immuuncel extracties. Belangrijk Deze techniek kan worden aangepast aan andere zachte en non-vezelige weefsels zoals de lever en hersenen 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben hier voorgesteld een methode om immune cellen van de nier op betrouwbare en efficiënte wijze te verkrijgen. De belangrijkste wijziging van de veelgebruikte collagenase digestie stap (mechanische verbreking van weefsel) bespaart ongeveer 30 min en de isolatie van een groot aantal levensvatbare immuuncellen duurt minder dan twee uur 4 niermonsters. Bovendien, afhankelijk van onze vraagstelling we nu met een enkele nier (de andere nier kan worden gebruikt voor eiwitanalyse door Western blots, immunohistochemie e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
Referenzen
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
