The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
우리는 생체 내에서 간단한 플랫폼을 통해 생성 된 비 바이러스 성 유전자 전달 벡터의 대안으로 선형 공유 폐쇄 (LCC) DNA의 minivectors을 구축 하였다. DNA의 ministrings이 높아진 안전성 프로파일을 보유하고 효율적으로 표적 세포에 DNA화물을 제공합니다. 기존의 DNA 벡터는 항생제 내성 유전자의 CpG 모티프 및 호스트 면역 반응의 자극으로 이어질 수 복제의 세균 기원을 포함 바람직하지 않은 원핵 시퀀스를 수행한다. 종래의 DNA 벡터의 생체 이용율은 또한 그들의 큰 분자 크기에 노출된다. 그들의 원형 성격도 삽입 성 돌연변이 유발로 이어지는 염색체 통합을 부여 할 수 있습니다.
세균 서열은 관심 (GOI) 필요한 진핵 발현 요소의 유전자를 떠나는 DNA의 minivectors로부터 절단된다. 우리의 LCC의 DNA의 minivectors, 또는 DNA의 ministrings는, 면역 원성 세균 서열의 결여이다; 따라서 일을 개선EIR 생체 이용률 및 GOI 식입니다. 염색체 내에 통합 벡터의 경우, LCC에 DNA의 ministring는 치명적함으로써 증식 세포 집단에서 위험한 돌연변이를 분리, 숙주 염색체를 중단한다. 바람직 벡터 통합 이벤트의 가능성을 제거하면서 결과적으로, DNA에 ministrings '는 minicircle'DNA의 이점을 제공한다. 기존의 플라스미드 및 동종 원형 공유 폐쇄 (CCC) 대응과 비교, DNA의 ministrings 우수한 생체 이용률, 형질 전환 효율 및 세포질 반응 속도를 보여 – 그들은 이렇게 표적 세포의 효율적인 형질 전환을위한 양이온 성 계면 활성제의 낮은 금액을 필요로한다.
우리가 사용하는 간단한 신속하고 확장 성이 대장균에서의 DNA ministrings 생산 용 생체 시스템에서 유도 한 단계를 구성하고있다.
목표는 공유 (LCC) DNA의 minivectors 간단한 고효율 원스텝 열 유도 생체 DNA ministring 생산 시스템을 사용하여 폐쇄 선형 확장 량을 생성한다. DNA의 ministrings는 DNA를 제공하는 안전하고 효과적인 비 바이러스 성 전략을 제공합니다. 이들은 DNA를 minicircles의 효율 LCC 벡터의 안전성을 결합하고, 또한 트랜 스펙 션 효율을 손상시키지 않으면 서 바이러스 유래 벡터에 안전한 대안을 제공한다.
성공하는 유전자 전달체 위해서는, DNA 벡터는 목적 숙주 세포를 선택하고 상기 인코딩 된 유전자 (들)을 표현한다. 특히 포유류 시스템에서 실제로 극복해야 할 여러 가지 세포 장벽이있다. 세망 내피 시스템에 의해 혈청 클레아 면역 검출에 의한 열화를 방지하기 위해, DNA 벡터는 타겟 시스템과 생체 면역 대응해야한다. 보호되지 않은 DNA는 빠르게 플라즈마 클레아 제에 의해 소화DNA 벡터 빠르게 표적 세포의 세포막을 횡단 할 수 있어야하므로 상기 플라스미드 막은 고밀도 지단백질 장벽 구성된다. 셀되면, 벡터는 세포질을 통과해야하며, 유전자 발현의 핵을 입력 핵 막을 통과. 비 바이러스 성 유전자 전달 방법은 세포 조직 – 타겟팅 향상에 초점을 맞춘다. 그러나, 이러한 종래 기술과 플라스미드의 사용으로 인해 빠르게 유전자 발현을 침묵 1,2- 세균 면역 원성 서열의 존재로 형질 전환 효율을 감소시킨다. 기존의 플라스미드는 일반적으로 원핵 생물 시스템의 유지 보수를 위해 항생제 내성 유전자를 수행한다. 그러나, 이러한 인간의 호스트의 잠재적 악영향을 수평 또는 천연 유전자 전달 효과를 통해 호스트 식물 발생에 대한 저항성을 부여 할 수있다. 기존의 플라스미드는 잠재적으로 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 뉴클레오티드의의 CpG 모티프 (2)를 포함감소 또는 유전자 발현을 침묵.
이들은 단독으로 진핵 발현 카세트로 구성되기 때문에, 이러한 DNA의 minicircles 3과 DNA의 minivectors들은 그들의 소형화 및 면역 원핵 요소의 유무에 그들이 세포 및 세포 내 생체 이용률 개선 된 유전자 발현을 향상 나타내는 한 유전자 전달을위한 더 나은 대안 4. 더 표적 부위 5 생체 내 투여와 관련된 전단력에 대한 저항에 대해 감소 된 벡터 크기 요금. 단위 질량 당 벡터의 높은 카피 수는, 따라서 독성을 감소 이하 형질 전환 시약을 필요로한다. 그러나, 숙주 염색체로 랜덤 벡터 통합의 경우, 원 공유 분자 연속성을 부여, DNA의 minicircles 종래 플라스미드 모두 포함 (CCC) 경로를 폐쇄하기 때문에 엄청난 결과를 가져올 수있다 삽입 성 돌연변이를 초래할 수있다 <s> 6입니다. 비교적 선형 DNA 벡터의 통합함으로써 증식하는 세포 집단에서 돌연변이 세포를 제거하고, 삽입 성 돌연변이 7 방지 세포사 경로를 염색체을 방해하고 개시한다. 최소한의 면역 학적으로 정의 된 유전자 발현 (미지) 벡터 (8)과 마이크로 선형 벡터 9 (MiLV)는 시험 관내에서 개발 LCC DNA 벡터이다. 미지 벡터는 종래의 플라스미드 DNA 벡터 (11)에 비해 생체 내에서 17 배 향상된 유전자 발현까지 발휘 한 백신 8 10 암 유전자 치료에 유망한 결과를 보여 주었다. 또한, LCC에 의한 minivector의 비틀림없는 구조 덜 형질 전환 시약 따라서 독성 7 감소 CCC 수퍼 코일 상대 비교하여 필요하다.
우리의 향상된 LCC의 DNA 벡터, DNA의 ministrings는 뛰어난 표현의 효율성과 bioavai을 증명하고있다불안정성 7. 또, DNA의 ministrings는 한 단계의 열 – 유도 생체 생산 시스템, 생체의 여러 단계를 필요로하고 미지 MiLV LCC 벡터에 합당하고 비용 효율적인 대안을 생성한다. 증명되는 DNA ministring 생산 시스템 그것을 만드는 생체 수행 간단한 열 유도 과정 모두 비용 효율적이고 쉽게 확장. 이 시스템은 예 르시 니아 enterocolitica PY54 박테리오파지 유래 텔 / PAL은 원핵 플라스미드 골격으로부터 최소 진핵 발현 카세트를 분리하는 재조합 시스템 12 protelomerase 이용한다. 우리는 열 유도 박테리오파지 λ 프로모터, CI [TS] 857 (13)의 제어하에 전화의 protelomerase을 표현하는 대장균을 대장균 세포 (W3NN)를 설계했다. 표현하면, 전화의 protelomerase는 "슈퍼 순서"(SS) 전구체 플라스미드에있는 사이트 내에 존재하는 친구의 표적 부위에 작용DNA의 ministring 후 (도 1)으로 정제 할 수있는 LCC 제품을 얻었다. DNA의 ministring 전구체 플라스미드 SS 사이트는 이에 한 전구체 플라스미드 동종 LCC 및 CCC에서 minivectors의 생산을 촉진 Cre 호텔 재조합 (LOX) TelN의 protelomerase (telRL) 및 FLP 재조합 효소 (FRT)를 포함하는 다른 콤비 네이즈의 대상 부위를 인코딩한다. 또한, 각 SS 사이트 핵 전좌 (14)을 개선하기 위해 게재 SV40 인핸서 (SV40e) 시퀀스에 의해 양쪽 측면된다. 우리는 SV40e의 연속 첨가가 점진적으로 형질 전환 효율 (7)에 해당 증가를 부여하는 것이 다른 곳에서 증명하고있다. 전구체 플라스미드 (pDNA에 MiniString 또는 PDMS)는 녹색 형광 기자 (GFP)와 전사 융합에 대한 관심이 원하는 유전자의 삽입을 용이하게하기 위해 폴리 링커 (그림 1)가 포함되어 있습니다.
DNA의 minivector 기술 수도진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현, 및 평가를위한 종래의 방법 대신에 사용된다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 "미니"벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 우리 강력한 원스텝 생산 플랫폼은 신속하고 쉽게 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings 생산 및 높은 안전성을 제공한다.
우리는 전형적인 박테리아 증식 및 조작에 사용되는 것을 제외하고 특별한 장치를 필요로하지 않는 단일 단계 열 – 유도 된 프로토콜을 사용하여 DNA의 LCC ministrings 생산 여기 간단한 시스템을 설명한다. DNA의 ministrings는 원핵 생물의 유전 적 요소가없는 비틀림이없는 안정적인 선형 DNA의 발현 카세트입니다. 이들은 진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현뿐만 아니라, 평가에 대한 종래의 방법 대신에 사용될 수있다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 "미니"벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 생체 내 생산 플랫폼 우리 강력한 한 단계가 빠르게 쉽게 여러 비용 체외 처리를 필요로하지 않고 임의의 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings를 생성한다.
몇 가지 중요한 단계가 있습니다최적의 ministring 생산 (그림 2, 3)를 확인합니다. 열 유도 생산을 ministring에 가장 중요한 단계입니다. 생산을 ministring의 전체 부족으로 인해 protelomerase 표현의 억압이 LCC의 ministring에 전구체 플라스미드의 변환을 방지 열 유도 (30 ° C로 유지 셀), 부족 가능성이 높습니다. 열 유도 프로토콜에 따라, 약 75 %의 생산 효율을 기대한다. 세포가 로그 상에있는 동안 열 유도에 최적입니다. ( "자란"도 3)를 고정상으로 세포를 사용할 때 PE를 ministring에서 통계적으로 유의 한 차이가 없다하더라도, 우리는 전체 플라스미드 수율은 거의 50 %의 감소를 관찰했다. 수율은 사용 된 플라스미드 추출 프로토콜에 의존 할 것이다. 세포를 로그 상에있는 동안 최적 ministring 생산 열 유도를 발생시킨다. 가난한 ministring 생산은 대부분 장기간 온도 업 시프트 또는 insufficie의 결과가 될 것입니다NT 온도 시프트. 이 E.이 활성화로 장기간 온도 업 시프트는 권장하지 않습니다 protelomerase 활성을 저해하고, 플라스미드 안정성을 방해 할 수있는 대장균 열 충격 응답 (15). 따라서, 온도 시프트 타이밍 ministring 효율적인 생산을위한 또 다른 중요한 단계이다. 30 ℃에서 추가 배양 시간없이 ministring 생산 효율이 매우 불량한 것으로 밝혀졌다 ( "조기 제거",도 3). 이것은 전화 발현과 활성에 필요한 시간에 기인 할 수있다. 원래 프로 파지 PY54 인코딩 전화의 protelomerase는 일반적으로 최적 30 ° C는 전화 활동에 더 최적화 될 수 있음을 나타내는, 약 28 ° C (12)을 성장 르시 니아를 감염.
DNA의 minivector 생산 시스템은 고품질의 세균 서열이없는 DNA의 minivectors를 생성하는 생체 플랫폼을 이용한다. 프로토콜에 대한 수정 난 할 수있다성장 단계에서 세포 증식 (대신 LB의 TB)을 촉진하거나, 생산 및 변환 효율 ministring 높이기 위해 플라스미드 단백질의 생산을 최적화하기 위해 성장 배지를 변경 nclude. 더 큰 문화 볼륨 (200 ㎖ 이상), 온도 하향 변속 및 30 ° C에서 배양을 위해 PE를 ministring에 심각한 부정적인 영향없이 야간 연장 될 수있다. 우리는 예를 들어 500 ml의 문화에 대한 우리의 프로토콜의 수정을 포함하고있다. DNA의 ministrings 정제 원핵 주쇄의 시험 관내 효소 분해를 통해 급송된다. 엔도 뉴 클레아 제 대상 사이트의 숫자가 있습니다 (예를 들어, PI-SceI 제한 효소, PvuI, SCAI) 개방 선을 노출 절단 할 수 전구체 플라스미드의 원핵 백본 볼 수는 원핵 백본의 체외 저하를 허용, 종료한다. 다른 벡터 종 ministrings의 분리는 음이온 교환막 크로마토 그래피 (16)를 통해 달성 될 수있다.
LCC DNA 벡터 생산 시스템과 관련된 하나의 전류 제한은 다른 LCC 및 CCC에서 제품의 ministring DNA 정제에 대한 필요성이다. 쉽게 표준 플라스미드 분리 방법을 사용하여 정제이지만, 분리 공정은 여전히 대규모 환경에서 불리 할 수있다. ministring의 분리는 시간이 많이 소요 ministring 및 LCC 원핵 세포 골격의 크기가 너무 비슷한 경우 AGE를 사용 할 수 있습니다. 선택적으로, 음이온 교환막 크로마토 그래피 CCC 벡터 종 (16)로부터의 ministrings 나은 분리를 제공 할 수있다. 고온도에서 E. 열충격 반응을 활성화 온도로 업 시프트는 다른 전위 제한 될 수있다 음의 재조합 단백질에 영향을 미치는 대장균은 17 산출 결과적으로 변환 ministring에 플라스미드의 요금을 줄일 수 있습니다. 우리는 생산 플랫폼의 최적화 회피 및 / 또는 열 충격 (18) 등의 영향을 완화하기 위해 다른 곳에서보고한다. 우리또한 현재 제거하거나 생체 내에서 LCC에게 원핵 백본 오염을 감소시키는 방법을 최적화한다.
LCC의 DNA의 ministring 염색체 통합 숙주 염색체을 방해하고 아폽토시스로 세포 주제. 뿐만 아니라이 같은 종양과 인접 유전자의 침묵함으로써 안전성을 향상시키는 등의 삽입 성 돌연변이 유발의 부정적 영향을 감소 않는다; 치사 효과도 관련된 부작용 및 통합의 손상없이 노킹 인 유전자 대체 연구에 적합한 방법이 될 수있다. DNA의 ministring 벡터는 생체 내에서 주어진 목표로 치료 단백질, RNA, 항체 또는 항원에 대한 유전자의 전달과 표현으로 적용되거나 오작동 또는 비 기능적인 대립 유전자를 대체 할 수 있습니다. 간단한 단계의 열 – 유도 생체 생산 시스템은 DNA의 ministring 벡터 쉽게 임상 또는 산업용으로 제조 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는이 작품을 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 감사합니다.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |