The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
我们构建线性共价闭合(LCC)的DNA minivectors经由体内一个简单的平台产生的非病毒基因递送载体的替代,DNA ministrings具有一个升高的安全性,也有效地提供的DNA货物到靶细胞。常规的DNA载体携带不希望的原核序列,包括抗生素抗性基因,CpG基序,和细菌复制起点,这可能导致的宿主免疫应答的刺激。常规DNA载体的生物利用度也受到影响,由于其更大的分子大小。其圆形性质也可赋予染色体整合,导致插入诱变。
细菌序列是从DNA minivectors切除,仅留下感兴趣的(GOI)的和必要的真核表达元件的基因。我们LCC DNA minivectors,或DNA ministrings,是缺乏免疫原性细菌的序列;因此,提高个EIR生物利用度和印度政府表达。在矢量积分的情况下入染色体中,LCC的DNA ministring将致死破坏宿主染色体,从而去除从增殖细胞群的潜在危险的突变体。因此,DNA ministrings提供“小环”DNA的好处,同时消除了不良的载体整合事件的可能性。相比于常规的质粒及其同基因型圆形共价闭合(CCC)的对应的DNA ministrings展示优越的生物利用度,转染效率,以及细胞质动力学 – 因而它们需要较低量为靶细胞的有效转染的阳离子表面活性剂。
我们已经构建了在大肠杆菌中生产的DNA ministrings的是使用简单,快速,可扩展的一步法体内系统诱导的。
的目标是产生线性共价闭合使用简单的和高效率的一步热诱导体内 DNA ministring生产系统(LCC)的DNA minivectors的伸缩量。 DNA ministrings提供一个安全,有效的非病毒性的策略来提供的DNA。他们结合的LCC载体的安全性与DNA小环的效率,并且还提供到病毒衍生的载体更安全的替代不影响转染效率。
为了使转基因递送系统是成功的,该DNA载体必须进入靶宿主细胞和表达编码转基因(多个)。有需要在实践中加以克服,特别是在哺乳动物系统几个细胞的障碍。为了通过网状内皮系统,以避免血清核酸酶和免疫检测退化,DNA载体必须是生物与目标系统免疫兼容。未受保护的DNA很快被血浆核酸酶消化和质粒膜由密集的脂蛋白障碍,使该DNA载体必须能够迅速地横过靶细胞的质膜。一旦在细胞中,载体必须遍历细胞质和穿过核膜以输入的转基因表达的核。非病毒基因传递技术侧重于增强组织特异性和细胞靶向。然而,这些技术的使用常规的质粒的降低转染效率由于免疫原性细菌序列的存在,从而迅速沉默基因表达的1,2-。传统的质粒一般带有抗生素抗性基因在原核系统的维护。然而,这些可能产生的人类宿主的潜在不利影响,或传授给通过基因水平转移的效果自然发生主机菌群阻力。常规的质粒还含有二核苷酸CpG基序2,其可以引发有害免疫反应,潜在地减少或沉默转基因的表达。
因为它们仅包含真核表达盒的,DNA minivectors如DNA小环3,是由于它们的减小的尺寸和缺乏免疫原核元件的,因为它们表现出改进的细胞外和细胞内的生物利用度和改进的基因表达的基因传递一个更好的选择4。减小的矢量大小票价相对于电阻与体内给药到靶位5相关联的剪切力更好。每单位质量的矢量的较高拷贝数的需要较少的转染试剂,从而降低毒性。然而,在随机矢量积分的情况下,进宿主染色体,圆共价闭合(CCC)的载体,包括DNA小环和常规质粒,赋予分子的连续性,因此可能导致插入诱变,其可具有破坏性的后果<s达> 6。比较,线性DNA载体整合破坏染色体并启动的细胞死亡途径,从而去除从增殖细胞群体的突变体细胞,并防止插入诱变7。简约免疫定义的基因表达(蚊)载体8和微型线性矢量9(MILV) 在体外开发LCC DNA载体。蠓载体已在体内表现出高达17倍提高转基因表达相对于传统的质粒DNA载体11,并且已经证明,在疫苗10和癌症8的基因治疗有希望的结果。此外,由于将LCC minivector的自由扭转的结构,较少的转染试剂,需要相比于CCC超螺旋的对应,从而降低毒性7。
我们的增强LCC DNA载体,DNA ministrings,都表现出了超强的表达效率和bioavai7不稳定。此外,DNA的ministrings是在一步法热诱导体内生产系统中,一个权宜和具有成本效益的替代蠓和MILV LCC载体,其需要在体外的多个步骤制备。该DNA ministring生产系统待证明是在体内进行的简单热诱导过程中,使其既具有成本效益和易于扩展。该系统利用了小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体PY54衍生电话/ PAL protelomerase重组系统12到最小的真核表达盒从原核表达载体主干分开。我们设计的大肠杆菌细胞(W3NN)的热诱导噬菌体λ启动子,CI [TS] 857 13的控制下,表达电话protelomerase。表达时,电话protelomerase作用于“超级顺序”(SS)位于前体质粒网站中存在PAL靶位点得到LCC产品,从其中DNA ministring然后可纯化( 图1)。在DNA ministring前体质粒的SS网站还编码为其他重组酶包括Cre重组酶(LOX),TELN protelomerase(telRL)和Flp重组(FRT)靶点,从而有利于从一个前体质粒生产等基因LCC和CCC minivectors的。此外,每个SS网站由SV40增强子(SV40e)序列,其用于改善核易位14在两侧。我们已经在别处证明,连续另外SV40e的逐步赋予的转染效率7相应增加。该前体的质粒(质粒DNA MiniString或PDMS)含有多接头( 图1),以促进在转录融合的绿色荧光报道(GFP)感兴趣的任何期望的基因的插入。
该DNA minivector技术可能代替用于基因转移,报道基因的表达,并朝向转基因表达的在真核系统中的效率评估的常规方法使用。 DNA ministrings结合生物相容性和线性DNA载体的优越的安全“迷你”载体提高转染效率的好处。我们强大的一步法生产平台,快速方便地生成DNA ministrings任何基因转移的应用程序,并提供了更高的安全性。
我们在这里描述为生产使用一步法热诱导协议,它不需要特殊的设备,除了这种处理是在典型的细菌的生长和操纵用于LCC DNA ministrings的一个简单的系统。 DNA ministrings是自由扭转,稳定的线性DNA表达盒,缺乏原核的遗传元件。它们可以代替用于基因转移,报道基因的表达,以及在朝向的转基因表达在真核系统中的效率评估的常规方法使用。 DNA ministrings结合生物相容性和线性DNA载体的优越的安全“迷你”载体提高转染效率的好处。我们的健壮一步法体内生产平台迅速和容易产生的DNA ministrings为任何基因转移应用程序,而不需要多个昂贵的体外处理。
有几个关键步骤确保最佳ministring生产( 图2和3)。热感应是ministring生产中最关键的一步。完全缺乏ministring生产是最有可能是由于缺乏热诱导(保持在30℃的细胞),其中protelomerase表达的抑制防止了前体的质粒的转化为LCC ministring的。以下的热感应协议,预期大约75%的生产效率。而细胞对数生长期热感应是最佳的。虽然目前在固定相当使用细胞(“杂草丛生”, 图3)ministring PE无统计学差异显著,我们确实观察到几乎整个质粒产量下降了50%。产率将取决于所用的质粒提取协议。对于最佳ministring生产,引发热感应而细胞处于对数期。差ministring生产将最有可能是长时间的温度升档或insufficie的结果nt的温度降档。长时间温度升档气馁,因为这会激活E.大肠杆菌热休克反应15,这可能抑制protelomerase活动,并与质粒稳定性造成干扰。因此,定时,温度降档是高效ministring生产另一关键步骤。如果没有在30℃额外孵化时间,ministring生产效率被认为是非常差(“早拆”, 图3)。这可以归因于的时间为电话表达和活性所需的量。始发噬菌体PY54编码电话protelomerase通常感染耶尔森 ,其最佳生长约28℃,12,这表明30℃也可以是用于电话活动更优化。
该DNA minivector生产系统利用体内平台上生成高质量的细菌无序列的DNA minivectors。修改该协议可能我nclude改变生长培养基,以优化的质粒和蛋白质生产,以促进在生长阶段的细胞生长(TB代替,LB),或增加ministring生产和转换效率。对于较大的培养体积(200 ml和更高),温度降档,并在30℃培养可过夜而对ministring PE严重的负面影响进行扩展。我们已在我们的500毫升文化作为一个例子协议的修改。 DNA ministrings纯化可通过原核生物骨干体外内切酶消化加快。有许多内切酶靶位点( 例如 ,PI-SceI位,PvuⅠ的,ScaI位)上的前体的质粒,其可被切割以暴露开放线性的原核骨干可用结束时,允许在原核骨架的体外降解。从其它载体物种ministrings分离也可以通过阴离子交换膜层析16来实现的。
与LCC DNA载体生产系统相关联的一个电流限制是用于从其它LCC和CCC产品的DNA ministring的纯化的需要。虽然很容易地用标准的质粒分离方法纯化,所述分离步骤还可以在大规模的设置的缺点。所述ministring分离可以是费时使用AGE如果ministring和LCC原核生物骨干在尺寸太相似了。另外,阴离子交换膜层析可以提供从CCC媒介物种16 ministrings更好的分离。温度升档可以是另一种潜在的限制,因为高温也激活在大肠杆菌中的热休克反应大肠杆菌 ,其负面影响重组蛋白产生17,从而减少质粒率ministring转换。我们在其他地方报告生产平台的优化,以规避和/或减轻热休克18的这种影响。我们目前还优化方法,以消除或减少LCC原核生物骨干污染体内 。
LCC的DNA ministring的染色体整合破坏宿主染色体和细胞科目凋亡。这不仅减少插入诱变诸如肿瘤发生和相邻基因的沉默,从而提高其安全性的潜在的负面影响;致死作用也可以作为敲除中和基因置换的研究没有相关的副作用和一体化的损伤的理想方法。的DNA ministring载体可以向基因用于治疗蛋白质,RNA,抗体,或抗原的体内转移和表达成给定的目标应用或更换造成故障或无功能的等位基因。在简单的一步热诱导体内生产系统允许用于临床或工业应用中容易产生的DNA ministring载体。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢加拿大自然科学和(NSERC)工程研究理事会资助这项工作。
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |