Productie van Dubbelstrengs DNA Ministrings
Summary
The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Abstract
Construeerden wij lineaire covalent gesloten (LCC) minivectors DNA als een niet-viraal gen-toedieningsvector alternatief geproduceerd via een eenvoudig platform in vivo. DNA ministrings een verhoogd veiligheidsprofiel bezitten en tevens efficiënte wijze DNA lading doelcellen. Conventionele DNA-vectoren dragen ongewenste prokaryotische sequenties, waaronder antibiotica resistentiegenen CpG motieven, en bacteriële oorsprongen van replicatie, wat kan leiden tot het stimuleren van gastheer immunologische reacties. De biologische beschikbaarheid van conventionele DNA vectoren ook verstoord door hun grotere moleculaire grootte. Hun ronde de natuur kan ook geven chromosomale integratie, wat leidt tot insertie mutagenese.
Bacteriële sequenties worden uitgesneden uit DNA minivectors, waardoor alleen het gen van belang (GOI) en noodzakelijke eukaryotische expressie-elementen. Onze LCC DNA minivectors of DNA ministrings, zijn verstoken van immunogeen bacteriële sequenties; dus het verbeteren van thEIR biologische beschikbaarheid en Indiase overheid expressie. Bij integratie vector in het chromosoom, de LCC DNA Ministring letaal verstoren de gastheerchromosoom, waardoor de potentieel gevaarlijke mutant van de prolifererende celpopulatie verwijderen. Bijgevolg DNA ministrings bieden de voordelen van 'minicircle' DNA terwijl het elimineren van de mogelijkheid van ongewenste vector integratie evenementen. In vergelijking met conventionele plasmiden en hun isogene covalent gesloten circulair (CCC) tegenhangers DNA ministrings tonen superieure biobeschikbaarheid, transfectie-efficiëntie en cytoplasmatische kinetiek – zij vereisen derhalve lagere hoeveelheden kationogene oppervlakteactieve stoffen voor effectieve transfectie van targetcellen.
We hebben in één stap induceerbaar in vivo voor de productie van DNA ministrings in Escherichia coli die eenvoudig te gebruiken, snelle en schaalbare geconstrueerd.
Introduction
Het doel is om schaalbare hoeveelheden lineaire covalent gesloten (LCC) DNA minivectors met een eenvoudige en hoog rendement eenstaps warmte induceerbare in vivo DNA Ministring productiesysteem produceren. DNA ministrings een veilige en effectieve niet-virale strategie om DNA te leveren. Zij combineren de veiligheid van LCC vectoren met de efficiëntie van DNA minicircles en bieden ook een veiliger alternatief voor virus afgeleide vectoren zonder dat transfectie efficiëntie.
Opdat een transgen afgiftesysteem succesvol te zijn, moet de DNA vector de beoogde gastheercel in en expressie van het gecodeerde transgen (en). Er zijn verschillende cellulaire barrières die overwonnen moeten worden in de praktijk, met name in zoogdiersystemen. Om afbraak door serum nucleasen en immunologische detectie door reticulo-endotheliale systeem, moet de DNA vector bio- en immuun-compatibel met doelsysteem zijn. Onbeschermde DNA wordt snel verteerd door plasma nucleasenen het plasmide membraan bestaat uit dichte lipoproteïne barrières zodat de DNA vector snel kunnen kruisen het plasmamembraan van doelcellen moeten zijn. Eenmaal in de cel, moet de vectoren cytoplasma doorkruisen en door het kernmembraan naar de kern van transgenexpressie voeren. Niet-virale gentherapie technieken gericht op verbetering van weefsel- en cel-targeting. Het gebruik van traditionele plasmiden met deze technieken vermindert transfectie efficiëntie door de aanwezigheid van bacteriële immunogene sequenties, die snel tot zwijgen genexpressie 1,2. Conventionele plasmiden typisch voeren antibiotica resistentiegenen voor het onderhoud in prokaryote systemen. Echter, deze kunnen in menselijke gastheren mogelijke schadelijke effecten te produceren en te geven van de weerstand tegen de natuur voorkomende gastheer flora via horizontale genoverdracht effecten. Conventionele plasmiden bevatten ook dinucleotide CpG motieven 2, dat ongewenst immunostimulerende reactie kan veroorzaken, potentieelhet verminderen of zwijgen transgenexpressie.
Zoals deze enkel bestaan uit de eukaryote expressiecassette DNA minivectors, zoals DNA minicircles 3, zijn een beter alternatief voor genafgifte mocht vertonen verbeterde extracellulaire en intracellulaire biobeschikbaarheid en verbeterde genexpressie vanwege hun geringere omvang en afwezigheid van immunostimulerende prokaryotische elementen 4. De gereduceerde vector formaat doet het beter met betrekking tot resistentie tegen afschuifkrachten geassocieerd met in vivo toediening aan een doelwitplaats 5. Hoe hoger aantal kopieën van de vector per massaeenheid minder transfectiereagens vereist, waardoor toxiciteit afneemt. In het geval van willekeurige vector integratie in een gastheerchromosoom, cirkelvormig covalent gesloten (CCC) vectoren, waaronder zowel DNA minicircles en conventionele plasmiden, geven moleculaire continuïteit en kan dan ook leiden tot mutagenese, die verwoestende gevolgen hebben <sup> 6. Relatief, integratie van een lineaire DNA vector verstoort het chromosoom en initieert celdood routes, waarbij de mutante cel van prolifererende celpopulatie bij het verwijderen van insertie mutagenese 7. Minimalistische immunologisch gedefinieerd genexpressie (MUG) vectoren 8 en micro-lineaire vectoren 9 (MiLV) zijn LCC DNA-vectoren ontwikkeld in vitro. MUG vectoren vertoonde tot een 17-voudige verbetering transgenexpressie in vivo vergeleken met conventionele plasmide DNA vectoren 11 en hebben veelbelovende resultaten vaccin 10 en kanker gentherapie 8 getoond. Bovendien, vanwege de torsievrije structuur van de LCC minivector minder transfectiereagens vereist in vergelijking met de CCC supercoil tegenhanger, waardoor toxiciteit 7 verminderen.
Onze verbeterde LCC DNA-vectoren, DNA ministrings, hebben superieure expressie efficiëntie en bioavai aangetoondlabiliteit 7. Bovendien zijn DNA ministrings geproduceerd op een eenstaps warmte induceerbare in vivo productiesysteem, een doelmatige en kosteneffectief alternatief voor MUG en MiLV LCC vectoren, die meerdere stappen in vitro vereist. De DNA Ministring productiesysteem worden aangetoond een eenvoudige warmte induceerbare werkwijze in vivo uitgevoerd, waardoor het zowel kosteneffectief en gemakkelijk schaalbaar. Dit systeem gebruikt de Yersinia enterocolitica bacteriofaag-PY54 afgeleide Tel / pal protelomerase recombinatie systeem 12 de minimale eukaryote expressiecassette scheiden van de prokaryote plasmideskelet. We hebben Escherichia coli gemanipuleerde cellen (W3NN) Tel protelomerase expressie onder controle van de hitte-induceerbare promoter λ bacteriofaag, cI [Ts] 857 13. Bij expressie, Tel protelomerase handelt pal doelsites aanwezig zijn binnen "Super Sequence" (SS) plaatsen op de voorloper plasmideLCC producten, waarvan de DNA Ministring vervolgens kan worden gezuiverd (figuur 1) werd verkregen. De SS plaatsen op het DNA Ministring precursor plasmide codeert ook doelplaatsen andere recombinases zoals Cre recombinase (LOX), TELN protelomerase (telRL) en Flp recombinase (FRT), waardoor de productie van isogene LCC en CCC minivectors vergemakkelijken van de ene precursor plasmide. Daarnaast is elke SS geflankeerd aan beide zijden door SV40 enhancer (SV40e) sequenties, die dienen om de nucleaire translocatie 14 verbeteren. We hebben elders aangetoond dat toevoeging van achtereenvolgens SV40e geleidelijk verleent overeenkomstige verhogingen van transfectie efficiency 7. De precursor plasmide (pDNA Ministring of PDMS) bevat een polylinker (figuur 1) om het inbrengen van elke gewenste gen van interesse transcriptionele fusie met de groene fluorescente reporter (GFP) te vergemakkelijken.
De DNA-technologie kan minivectorworden gebruikt in plaats van gebruikelijke werkwijzen voor genoverdracht expressie van reportergenen en evaluaties naar de efficiëntie van transgene expressie in eukaryote systemen. DNA ministrings combineren de biocompatibiliteit en meer voordelen transfectie efficiëntie van "mini" vectoren met de superieure veiligheidsprofiel van lineair DNA vectoren. Onze robuuste one-step productie platform snel en gemakkelijk produceert DNA ministrings voor elk gen overdracht toepassing en biedt een hogere veiligheidsprofiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een eenvoudig systeem voor de productie van LCC DNA ministrings middels een stap hitte-induceerbare protocol, waarbij geen speciale apparatuur vereist afgezien van die welke wordt gebruikt in de typische bacteriegroei en manipulatie. DNA ministrings zijn torsie-vrij, stabiele lineaire DNA-expressiecassettes, verstoken van prokaryotische genetische elementen. Zij kunnen worden gebruikt in plaats van gebruikelijke werkwijzen voor genoverdracht expressie van reportergenen, maar ook in evaluaties naar de efficiëntie van transgene expressie in eukaryote systemen. DNA ministrings combineren de biocompatibiliteit en meer voordelen transfectie efficiëntie van "mini" vectoren met de superieure veiligheidsprofiel van lineair DNA vectoren. Onze robuuste éénfasige in vivo productieplatform snel en gemakkelijk produceert ministrings DNA voor genoverdracht applicatie zonder de noodzaak voor meerdere dure in vitro werkwijzen.
Er zijn verschillende kritische stappen teoptimale Ministring productie (figuren 2 en 3). Hitte inductie is de meest kritische stap om Ministring productie. Volledig gebrek aan Ministring productie waarschijnlijk door een gebrek aan warmte inductie (cellen bij 30 ° C gehouden), waarbij onderdrukking van protelomerase expressie verhindert omzetting van precursor plasmide LCC Ministring. Naar aanleiding van de hitte inductie protocol, verwacht een productie-efficiëntie van ongeveer 75%. Heat inductie is optimaal, terwijl cellen in log-fase. Hoewel er geen statistisch significant verschil in Ministring PE bij gebruik van cellen in de stationaire fase ( "Overwoekerde", figuur 3), we waarnemen bijna 50% daling van de totale opbrengst plasmide. Opbrengst zal afhangen van het plasmide extractie protocol. Voor een optimale Ministring productie, leiden tot warmte inductie, terwijl cellen in log-fase. Arme Ministring productie zal zeer waarschijnlijk een gevolg van langdurige temperatuur opschakelen of insufficie zijnnt temperatuur terugschakelen. Langdurige temperatuur opschakelen wordt afgeraden omdat dit activeert de E. coli heat shock respons 15, die protelomerase activiteit kan remmen en interfereren met plasmide stabiliteit. Daarom is de timing van de temperatuur terugschakelen is een cruciale stap voor een efficiënte Ministring productie. Zonder bijkomende incubatietijd bij 30 ° C, werd Ministring productie-efficiëntie blijkt zeer slecht te zijn ( "Early Removal", figuur 3). Dit kan worden toegeschreven aan de hoeveelheid tijd die nodig Tel expressie en activiteit. De van oorsprong profaag PY54 encoding Tel protelomerase normaal infecteert Yersinia, die optimaal groeit rond de 28 ° C 12, wat aangeeft dat 30 ° C ook optimaal voor Tel activiteit kan zijn.
De DNA minivector productie-systeem maakt gebruik van een in-vivo-platform van hoge kwaliteit bacteriële sequentie-vrij DNA minivectors te genereren. Wijzigingen in het protocol kan include wijziging van de groeimedia plasmide en eiwitproductie optimaliseren om celgroei tijdens de groeifase (TB plaats van LB) bevorderen of verhogen Ministring productie en omzettingsefficiëntie. Voor grotere cultuur volumes (200 ml en hoger), de temperatuur terugschakelen en incubatie bij 30 ° C kan overnacht worden verlengd zonder ernstige negatieve impact op Ministring PE. We hebben opgenomen modificaties in ons protocol voor 500 ml kweken als voorbeeld. Zuivering van DNA ministrings kan worden versneld door middel van in vitro endonuclease digestie van het prokaryote backbone. Er zijn een aantal endonuclease doelplaatsen (bijvoorbeeld PI-SceI, PvuI, Seal) op de prokaryotische ruggengraat van de precursor plasmide, die kan worden gesneden open einden bloot lineaire, waardoor in vitro degradatie van de prokaryote backbone. Isolatie van ministrings uit andere vector species kunnen ook worden bereikt door anionuitwisselingsmembraan 16 chromatografie.
Een stroombegrenzing geassocieerd met de LCC DNA vector productiesysteem is de behoefte aan zuivering van het DNA uit andere Ministring LCC en CCC producten. Hoewel gemakkelijk gezuiverd met behulp van standaard plasmide isolatiemethoden, kan de isolatiestap nog een nadeel grootschalige setting. Scheiding van de Ministring kan tijdrovend met behulp van AGE als de Ministring en de LCC prokaryote ruggengraat zijn ook vergelijkbaar in grootte zijn. Als alternatief kan anionuitwisselingsmembraan chromatografie betere scheiding van ministrings van CCC vector species 16 verschaffen. Temperatuur opschakelen kan een andere potentiële beperking als hoge temperaturen ook de heat shock respons in E. activeren coli die recombinant eiwit negatief effect oplevert 17 en daardoor tarieven plasmide verminderen Ministring conversie. Wij rapporteren elders optimalisatie van de productie-platform te omzeilen en / of dergelijke effecten van heat shock 18 verzachten. Wijworden momenteel ook het optimaliseren van methoden op te heffen of te verminderen LCC prokaryotische backbone besmetting in vivo.
Chromosomale integratie van de DNA LCC Ministring verstoort de gastheerchromosoom en onderwerpt de cel apoptose. Niet alleen heeft deze vermindering van de potentiële negatieve gevolgen van mutagenese zoals oncogenese en silencing van aangrenzende genen, waardoor de veiligheid te verbeteren; het letale effect kan ook dienen als een ideale methode voor het uitschakelen in en genvervanging studies zonder de bijbehorende bijwerkingen en beschadigingen van integratie. Ministring DNA vectoren kunnen worden toegepast op de overdracht en expressie van genen voor therapeutische eiwitten, RNA, antilichamen of antigenen in een gegeven doel in vivo of vervanging van een storing of niet-functioneel allel. De eenvoudige eenstaps warmte induceerbare in vivo productiesysteem laat Ministring DNA vectoren gemakkelijk worden geproduceerd voor klinische of industriële toepassingen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) voor de financiering van dit werk.
Materials
| E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
| Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
| Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
| Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
| Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
| Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
| Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
| Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
| Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
Referenzen
- Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
- Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
- Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
- Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
- Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
- Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
- Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
- Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
- Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
- López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
- Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
- Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
- Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).
- Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
- Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
- Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).
