El ARN total de alta calidad se ha preparado a partir de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratón mediante microdisección de captura láser después de manchar secciones de la médula espinal con Azure B en etanol al 70%. Suficiente ARN (~ 40-60 ng) se recupera de 3.000-4.000 neuronas motoras para permitir el análisis de ARN aguas abajo por RNA-seq y qRT-PCR.
La preparación de ARN de alta calidad a partir de células de interés es fundamental para el análisis preciso y significativo de las diferencias transcripcionales entre los tipos celulares o entre el mismo tipo de célula en la salud y la enfermedad o después de tratamientos farmacológicos. En la médula espinal, tal preparación de las neuronas motoras, el objetivo de interés en muchas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, se complica por el hecho de que las neuronas motoras representan <10% de la población celular total. La microdisección de captura láser (LMD) se ha desarrollado para abordar este problema. Aquí, se describe un protocolo para recuperar rápidamente, congelar, y la sección de la médula espinal del ratón para evitar el daño del ARN por RNasas endógenas y exógenas, seguido de tinción con Azure B en etanol al 70% para identificar las neuronas motoras mientras se mantiene la ARNasa endógena inhibida. LMD se utiliza entonces para capturar las neuronas teñidas directamente en el almacenador intermediario de la lisis del tiocianato de guanidina, manteniendo integridad del ARN. Se utilizan técnicas estándar para recuperar el ARN total y medir su integridad. Este material se puede entonces utilizar para el análisis rio abajo de las transcripciones por RNA-seq y qRT-PCR.
En tejidos de mamíferos compuestos por múltiples tipos de células diferentes, el advenimiento de la instrumentación de microdisección de captura láser (LMD) ha brindado la posibilidad de seleccionar un tipo de célula específica para su análisis a nivel de ARN o proteína. En la actualidad, la amplificación y las técnicas de secuenciación de próxima generación permiten el uso de una reserva de ARN total de unos pocos miles de células para obtener un inventario relativamente completo del transcriptoma, incluida la evaluación de los niveles relativos de ARN y la identificación de varias formas empalmadas. Hasta la fecha, los análisis proteómicos de unos pocos miles de células llegarán a través de especies más abundantes. Por ejemplo, hemos identificado <1,000 de las proteínas más abundantes de 3,000-4,000 cuerpos celulares de neuronas motoras (no mostradas), y Zhu y sus compañeros de trabajo han reportado recientemente la identificación de 2,665 proteínas de ~ 15,000 células tumorales1. Sin embargo, con nuevos desarrollos de la espectrometría de masas, es probable que tales análisis se extiendan a una profundidad mucho mayor.
Aquí, presentamos un protocolo específico utilizado para LMD de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratones, seguido de la preparación de ARN. Este protocolo se utilizó en el contexto de la comparación de ARN de neuronas motoras de ratones mutantes transgénicos presintomáticos de superóxido dismutasa (SOD)1 de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) con ARN preparados a partir de una cepa transgénica de tipo salvaje SOD1 por validación de ARN-seq y qRT-PCR2. En particular, las neuronas motoras, en el cuerno anterior de la materia gris en la médula espinal, comprenden <10% de la población celular total, rodeadas por un mar de astrocitos, y como tal, su perfil transcripcional no puede ser fácilmente desconvolucionado de los estudios de toda la cuerda. Un acercamiento de la captura del laser es así ideal para analizar la expresión del ARN en estas células, con la fisiología preservada excising y congelando rápidamente la cuerda que sigue la breve perfusión salina intracardiaca. Los somata de la neurona de motor son grandes y son así fácilmente perceptibles, aquí usando un tinte que tenga afinidad fuerte para las neuronas3. Además, con tal tamaño, estas células proporcionan una cantidad relativamente grande de ARN por célula capturada. El procedimiento utilizado, como se detalla a continuación, podría ajustarse fácilmente para obtener otros tipos de células neuronales, así como potencialmente otros tipos de células, identificados específicamente por técnicas de tinción de tintes o por tinción de anticuerpos.
La medida más significativa de éxito de este protocolo para la producción de ARN total por microdisección láser de rodajas de la médula espinal es el valor de RIN5. Para las muestras de ARN de eucariotas superiores, los valores superiores a 8,5 producen regularmente datos de secuenciación de alta calidad y qRT-PCR. Si el rendimiento es bajo pero la calidad es alta, repita la preparación. Sin embargo, si la integridad es menor (incluso 7.5-8), es mejor encontrar el origen del problema e intentarlo de nuevo. Hay muchos pasos en los que algo puede salir mal, pero en realidad sólo dos fuentes del problema – contaminación endógena por ARNasa o contaminación por ARNasa exógena. El primero se puede abordar mediante la práctica, de modo que se minimice el tiempo desde el sacrificio del ratón hasta la congelación de su cable integrado O.C.T. El otro punto en el protocolo donde la ARNasa endógena puede contribuir a un resultado pobre es durante la preparación de las rebanadas. Cada rebanada debe adherirse a un portaobjetos PEN a temperatura ambiente rápidamente, pero se derretirá (el O.C.T se vuelve claro). Cuanto más rápido se pueda volver a congelar la rebanada, mejor. El criostato que utilizamos tiene superficies planas dentro de la cámara que están a -20 °C, que utilizamos para volver a congelar rápidamente la rebanada. Encuentre un lugar similar en el criostato utilizado y asegúrese de que la rebanada vuelva a ser opaca rápidamente.
Rastrear las fuentes de ARNasa exógena puede ser difícil, porque hay muchas posibilidades. Los únicos reactivos usados que no están expresamente libres de RNase son O.C.T. y Azure B. Si el Azure B ha funcionado satisfactoriamente antes, pruebe una botella fresca de O.C.T., aunque este reactivo nunca ha sido un problema. Los reactivos libres de ARNasa también pueden ser reemplazados, incluso de un proveedor diferente. Una fuente mucho más probable es el investigador. Además de una limpieza exhaustiva del área de trabajo, a menudo es útil que otro miembro del laboratorio siga y observe todos los pasos del procedimiento. Incluso si se trata de alguien que no realiza rutinariamente este procedimiento, un nuevo conjunto de ojos puede recoger una fuente de contaminación que de otra manera pasaría desapercibida.
Extender este protocolo a la recuperación de ARN de otras células de la médula espinal, de células de la médula espinal de otras especies, o de tipos específicos de células en otros órganos requerirá modificaciones en varias áreas dirigidas a lograr una identificación clara de las células de interés, evitando, o al menos minimizando, el impacto de la ARNasa endógena. En el protocolo aquí, la rápida eliminación y congelación del cable, junto con la tinción de Azure B en etanol al 70%, permitió tanto la minimización de la degradación del ARN como la fácil identificación de los cuerpos celulares de las neuronas motoras. Azure B es una mancha histoquímica bien establecida para neuronas que parece unirse al ARN3 y se ha utilizado para evaluar el contenido de ARN de las neuronas en muestras de autopsia de tejido cerebral de pacientes con enfermedad neurodegenerativa6. En particular, la tinción de Azure B no afectó a la integridad del ARN purificado ni a su capacidad para transcribirse y analizarse inversamente. Otros tintes, como la violeta cresil7 y el azul toluidina8 se han utilizado en protocolos lmd similares. La recolección de los cuerpos celulares directamente en la solución de tiocianato de guanidina a medida que se diseccionaban proporcionó el paso final que resultó en la recuperación rutinaria de ARN intacto.
Acercamientos similares se pueden prever para otras células y órganos, reconociendo que la identificación de las células del interés mientras que minimiza o, preferiblemente, previene la degradación del ARN por RNases endógenos es el requisito crítico para el análisis acertado. En tejidos que tienen altos niveles de ARNasa, como el páncreas, el manejo rápido y la baja temperatura se han combinado para permitir la recuperación del ARN de las células β, aprovechando su autofluorescencia natural para la visualización9. Los procedimientos que utilizan la coloración del anticuerpo para la identificación también se han divulgado10,pero no han sido completamente acertados en nuestras manos. Finalmente, hay muchos modelos de ratón disponibles que expresan proteínas de fusión fluorescentes(es decir, GFP, YFP, RFP) en células de interés, que podrían usarse para identificarlas en secciones de tejido en el microscopio LMD. De hecho, las cepas de ratón que hemos analizado con este protocolo expresan una proteína de fusión entre SOD1 y YFP11,y sus neuronas motoras de la médula espinal son altamente fluorescentes. No pudimos, sin embargo, encontrar un conjunto de lavados de etanol y / o condiciones de deshidratación que eliminarían simultáneamente el O.C.T., inhibirían la actividad de la ARNasa y mantendrían consistentemente suficiente fluorescencia de YFP para permitir la visualización de las neuronas motoras y su recuperación por LMD. Tal vez una nueva proteína fluorescente o una variante de las disponibles que mantiene la fluorescencia en disolventes orgánicos se puede encontrar para superar esta limitación.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a George Farr y a los miembros del laboratorio de Horwich por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |