고품질 총 RNA는 70% 에탄올에 Azure B로 척수 섹션을 염색한 후 레이저 포획 마이크로디스트섹션에 의해 마우스 척수 모터 뉴런의 세포체로부터 제조되었다. 충분한 RNA(~40-60 ng)는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 하류 RNA 분석을 허용하기 위해 3,000-4,000개의 모터 뉴런으로부터 회수된다.
관심 있는 세포로부터 고품질 RNA의 준비는 세포 모형 사이 또는 건강과 질병에서 동일 세포 모형 사이 또는 약리학 처리를 따르는 전사 다름의 정확하고 의미 있는 분석에 중요합니다. 척수에서, 많은 신경학및 신경퇴행성 질병에 대한 관심의 대상인 운동 뉴런의 이러한 준비는 운동 뉴런이 전체 세포 인구의 <10%를 나타낸다는 사실에 의해 복잡합니다. 레이저 포획 마이크로절(LMD)은 이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 내인성 및 외인성 RNases에 의한 RNA 손상을 피하기 위해 마우스 척수를 신속하게 복구, 동결 및 섹션 마우스 척수를 하는 프로토콜을 설명하고, 다음 70% 에탄올에서 Azure B로 염색하여 내인성 RNase억제를 유지하면서 운동 신경을 식별합니다. LMD는 그 때 RNA 무결성을 유지하면서 구아니딘 틸리오네이트 용해 완충안으로 직접 스테인드 뉴런을 포착하는 데 사용된다. 표준 기술은 총 RNA를 복구하고 무결성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 물질은 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 성적증명서의 다운스트림 분석에 사용될 수 있다.
다중 상이한 세포 유형으로 구성된 포유류 조직에서, 레이저 포획 미세 절(LMD) 계측의 출현은 RNA 또는 단백질 수준에서 분석을 위한 특정 세포 유형을 선택할 수 있는 가능성을 부여했다. 현재, 증폭 및 차세대 염기서열기는 몇 천 개의 세포로부터 총 RNA 풀을 사용하여 RNA의 상대적 수준의 평가 및 다양한 접합 형태의 식별을 포함하여 전사의 비교적 철저한 재고를 얻을 수 있게 한다. 현재까지, 몇 천 세포의 proteomics 분석은 단지 더 풍부한 종을 통해 아래로 도달 할 것이다. 예를 들어, 3,000-4,000개의 운동 신경 세포 체(도시되지 않음)에서 가장 풍부한 단백질의 <1,000을 확인했으며, 주및 동료들은 최근 ~15,000종양 세포1에서2,665개의 단백질을 식별하는 것으로 보고하였다. 그러나 질량 분석의 추가 발전과 함께 이러한 분석은 훨씬 더 깊이까지 확장 될 가능성이 높습니다.
여기서는 마우스 척수에서 운동 신경 세포 체의 LMD에 사용되는 특정 프로토콜을 제시하고 RNA의 준비에 선행합니다. 이 프로토콜은 RNA-seq 및 qRT-PCR 유효성 검사2에의해 야생형 SOD1 형질화균으로부터 제조된 RNA를 가진 전증상 형 형질산성 돌연변이 염기산염(SOD)1 근위축성 측삭 경화증(ALS) 마우스의 운동 뉴런으로부터 RNA를 비교하는 맥락에서 사용되었다. 특히, 척수의 회색 물질의 전방 경적에서 모터 뉴런은 성상세포 의 바다로 둘러싸인 전체 세포 인구의 <10 %를 구성하며, 따라서 그들의 전사 프로필은 전체 코드의 연구에서 쉽게 감소 될 수 없습니다. 레이저 포획 접근법은 따라서 이 세포에 있는 RNA 발현을 분석하기 에 이상적입니다, 생리학은 짧은 심혈 내 식염수 관류에 따라 코드를 급속하게 절제하고 동결하여 보존됩니다. 모터 뉴런 소마타는 크고 따라서 쉽게 감지할 수 있으며, 여기서는 뉴런에 대한 강한 친화력을 가진 염료를 이용하여3. 또한, 이러한 크기로, 이들 세포는 상대적으로 많은 양의 RNA를 캡처한 세포당 제공한다. 아래에 자세히 설명된 바와 같이 사용되는 절차는 염색 기술이나 항체 염색에 의해 구체적으로 확인된 잠재적으로 다른 세포 유형뿐만 아니라 다른 세포 유형을 얻기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
척수 슬라이스의 레이저 미세 절에 의해 총 RNA를 생산하기위한이 프로토콜의 성공의 가장 중요한 척도는 RIN 값5입니다. 더 높은 진핵생물에서 RNA 견본을 위해, 8.5 이상의 값은 정기적으로 고품질 염기서열 분석 및 qRT-PCR 데이터를 산출합니다. 수율이 낮지만 품질이 높으면 준비를 반복하십시오. 그러나 무결성이 낮은 경우 (심지어 7.5-8), 그러나, 문제의 원인을 찾아 다시 시도하는 것이 좋습니다. 뭔가 잘못 될 수 있는 많은 단계가 있다, 하지만 정말 문제의 두 소스-내 인 성 RNase 오염 또는 외 인 RNase 오염. 첫 번째는 연습으로 해결될 수 있으므로 마우스 희생에서 O.C.T 임베디드 코드를 동결하는 시간을 최소화할 수 있습니다. 내인성 RNase가 나쁜 결과에 기여할 수 있는 프로토콜의 다른 점은 슬라이스를 준비하는 동안입니다. 각 슬라이스는 실온 PEN 슬라이드를 빠르게 부착해야 하지만 녹아요(O.C.T가 명확해집니다). 슬라이스를 더 빨리 재고정할수록 더 좋습니다. 우리가 사용하는 냉동고스트는 -20 °C에있는 챔버 내부의 평평한 표면을 가지고 있으며, 슬라이스를 신속하게 재고정하는 데 사용합니다. 사용된 극저온에서 비슷한 지점을 찾아 슬라이스가 다시 빠르게 불투명해지는지 확인합니다.
너무 많은 가능성이 있기 때문에 외인성 RNase의 근원을 추적하는 것은 어려울 수 있습니다. 명시적으로 RNase가 없는 유일한 시약은 O.C.T. 및 Azure B입니다. Azure B가 이전에 만족스럽게 수행한 경우 이 시약이 문제가 되지 않았지만 O.C.T.의 새 병을 시도해 보십시오. RNase 가없는 시약은 다른 공급 업체에서도 교체 할 수 있습니다. 훨씬 더 가능성이 소스는 조사자입니다. 작업 영역의 철저한 정리 외에도 다른 랩 멤버가 따라가서 절차의 모든 단계를 관찰하는 것이 종종 유용합니다. 이 절차를 일상적으로 수행 하지 않는 사람이 더라도, 눈의 신선한 세트 오염의 그렇지 않으면 주목 소스를 선택할 수 있습니다.
다른 척수 세포에서 RNA를 복구하는 이 프로토콜을 확장, 다른 종에서 척수 세포에서, 또는 다른 장기의 특정 세포 유형에서 외설하는 동안 관심세포의 명확한 식별을 달성하기위한 여러 영역에서 수정이 필요합니다, 또는 적어도 최소화, 내인성 RNase의 영향. 여기서 프로토콜에서, 70% 에탄올에 있는 Azure B 염색과 결합된 코드의 급속한 제거 및 동결은, RNA 분해의 최소화 및 운동 신경 세포 바디의 쉬운 식별을 둘 다 허용했습니다. Azure B는 RNA3에 결합하는 것처럼 보이는 뉴런을 위한 잘 확립된 히스토케미컬 얼룩으로, 신경퇴행성 질환 환자로부터 뇌 조직의 부검 샘플에서 뉴런의 RNA 함량을 평가하는 데 사용되어 왔다6. 특히 Azure B 염색은 정제된 RNA의 무결성 또는 역전사 및 분석기능에 영향을 미치지 않았습니다. 크레실 바이올렛7 및 톨루이딘 블루8과 같은 다른 염료는 유사한 LMD 프로토콜에 사용되어 왔다. 그(것)들이 해부된 으로 구아니딘 thiocyanate 용액으로 직접 세포 바디를 수집하는 것은 그대로 RNA의 일상적인 복구귀착되는 마지막 단계를 제공했습니다.
유사한 접근법은 다른 세포와 장기를 위해 구상될 수 있고, 내인성 RNases에 의한 RNA 분해를 방지하는 동안 관심 있는 세포를 식별하는 것이 성공적인 분석을 위한 중요한 요구 사항임을 인식할 수 있다. 췌장과 같은 RNase의 높은 수준을 갖는 조직에서, 급속한 취급 및 저온은 시각화를 위한 그들의 자연적인 자동 형광을 이용하여, β 세포에서 RNA의 복구를 허용하기 위하여 결합되었습니다9. 신원 확인을 위해 항체 염색을 이용한 절차도10을보고되었지만, 우리의 손에 완전히 성공하지는 못했습니다. 마지막으로, 많은 마우스 모델은 LMD 현미경의 조직 섹션에서 이를 식별하는 데 사용될 수 있는 관심 있는 세포에서 형광 융합단백질(즉, GFP, YFP, RFP)을 발현하는 것을 사용할 수 있다. 사실, 우리가 이 프로토콜로 분석한 마우스 긴장은 SOD1과 YFP11사이의 융합 단백질을 발현하고, 그들의 척수 모터 뉴런은 높게 형광이다. 그러나 O.C.T.를 동시에 제거하고, RNase 활동을 억제하고, LMD에 의한 운동 뉴런의 시각화와 회복을 가능하게 하는 충분한 YFP 형광을 일관되게 유지하는 에탄올 세차및/또는 탈수 조건 세트를 찾을 수 없었습니다. 아마도 새로운 형광 단백질 또는 유기 용매에서 형광을 유지하는 사용 가능한 것들의 변이체는 이러한 한계를 극복하기 위해 발견 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 도움이 토론을 조지 파와 호지 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소에 의해 지원되었다.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |