RNA כולל באיכות גבוהה הוכן מגופי תאים של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר microdissection לאחר הכתמת מקטעי חוט השדרה עם תכלת B ב 70% אתנול. מספיק RNA (~ 40-60 ng) הוא התאושש מ 3,000-4,000 נוירונים מוטוריים כדי לאפשר ניתוח RNA במורד הזרם על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.
הכנת RNA באיכות גבוהה מתאי עניין היא קריטית לניתוח מדויק ומשמעותי של הבדלים שעתוק בין סוגי תאים או בין אותו סוג תא בבריאות ומחלות או בעקבות טיפולים תרופתיים. בחוט השדרה, הכנה כזו של נוירונים מוטוריים, היעד של עניין במחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות רבות, מסובך על ידי העובדה כי נוירונים מוטוריים מייצגים <10% מכלל אוכלוסיית התאים. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LMD) פותחה כדי לטפל בבעיה זו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לשחזר במהירות, להקפיא, סעיף חוט השדרה של העכבר כדי למנוע נזק RNA על ידי RNases אנדוגני אקסוגני, ואחריו כתמים עם תכלת B ב 70% אתנול כדי לזהות את הנוירונים המוטוריים תוך שמירה על RNase אנדוגני מעוכב. LMD משמש לאחר מכן כדי ללכוד את הנוירונים מוכתמים ישירות לתוך מאגר תמוגה guanidine thiocyanate, שמירה על שלמות RNA. טכניקות סטנדרטיות משמשות כדי לשחזר את RNA הכולל ולמדוד את השלמות שלה. חומר זה יכול לשמש לאחר מכן לניתוח במורד הזרם של התמלילים על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.
ברקמות יונקים המורכבות מסוגי תאים שונים מרובים, הופעתו של מכשור microdissection לכידת לייזר (LMD) אפשרה את האפשרות לבחור סוג תא מסוים לניתוח ברמת RNA או חלבון. כיום, הגברה וטכניקות רצף מהדור הבא מאפשרות שימוש במאגר של RNA כולל מכמה אלפי תאים כדי לקבל מלאי יסודי יחסית של התמלול, כולל הערכה של רמות יחסיות של RNAs וזיהוי של צורות שחבורות שונות. עד כה, ניתוחי פרוטאומיקה של כמה אלפי תאים יגיעו למטה רק דרך מינים שופעים יותר. לדוגמה, זיהינו <1,000 החלבונים הנפוצים ביותר בין 3,000-4,000 גופי תאי נוירון מוטוריים (לא מוצג), ו Zhu ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה זיהוי 2,665 חלבונים ~ 15,000 תאים סרטניים1. עם זאת, עם התפתחויות נוספות של ספקטרומטריית מסה, סביר להניח שניתוחים כאלה יתרחבו לעומק גדול בהרבה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ספציפי המשמש LMD של גופי תא נוירון מוטורי מחוט השדרה של עכברים, ואחריו הכנת RNA. פרוטוקול זה שימש בהקשר של השוואת RNAs מתאי עצב מוטוריים של מוטציה טרנסגנטית טרום-תסמינית סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD)1 עכברי טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS) עם RNAs שהוכנו מזן מהונדס SOD1 מסוג פראי על ידי אימות RNA-seq ו- qRT-PCR2. יש לציין כי נוירונים מוטוריים, בקרן האצילית של החומר האפור בחוט השדרה, מהווים <10% מכלל אוכלוסיית התאים, מוקפים בים של אסטרוציטים, וככאלה, לא ניתן לזלזל בקלות בפרופיל השעתוק שלהם ממחקרים על חבל הטבור כולו. גישת לכידת לייזר היא אפוא אידיאלית לניתוח ביטוי RNA בתאים אלה, עם פיזיולוגיה השתמרה על ידי כריתה מהירה והקפאה של החוט בעקבות זלוף מלוחים תוך-ארדיאק קצר. סומטה נוירון מוטורי הם גדולים ולכן ניתן לזהות בקלות, כאן באמצעות צבע כי יש זיקה חזקה נוירונים3. בנוסף, עם גודל כזה, תאים אלה מספקים כמות גדולה יחסית של RNA לכל תא שנתפס. ההליך המשמש, כמפורט להלן, יכול להיות מותאם בקלות כדי להשיג סוגי תאים עצביים אחרים, כמו גם סוגי תאים אחרים פוטנציאליים, מזוהה במיוחד על ידי טכניקות כתמי צבע או על ידי כתמי נוגדנים.
המדד המשמעותי ביותר של הצלחה של פרוטוקול זה לייצור RNA הכולל על ידי מיקרו-דיסקציה לייזר של פרוסות חוט השדרה הוא ערך RIN5. עבור דגימות RNA מאוקריוטים גבוהים יותר, ערכים מעל 8.5 מניבים בקביעות רצף באיכות גבוהה ונתוני qRT-PCR. אם התשואה נמוכה אך האיכות גבוהה, חזור על ההכנה. אם השלמות נמוכה יותר (אפילו 7.5-8), עם זאת, עדיף למצוא את מקור הבעיה ולנסות שוב. ישנם צעדים רבים שבהם משהו יכול להשתבש, אבל באמת רק שני מקורות של הבעיה – זיהום RNase אנדוגני או זיהום RNase אקסוגני. הראשון יכול להיות מטופל על ידי תרגול, כך הזמן מהקרבת העכבר להקפאת כבל O.C.T מוטבע שלה הוא ממוזער. הנקודה השנייה בפרוטוקול שבו RNase אנדוגני יכול לתרום לתוצאה גרועה היא במהלך הכנת הפרוסות. כל פרוסה צריכה לדבוק בשקופית PEN בטמפרטורת החדר במהירות, אך היא תימס (O.C.T מתבהר). ככל שהפרוסה מהירה יותר, כך טוב יותר. cryostat אנו משתמשים יש משטחים שטוחים בתוך התא כי הם ב -20 מעלות צלזיוס, שבו אנו משתמשים כדי להפשיר במהירות את הפרוסה. מצא נקודה דומה cryostat בשימוש ולוודא את הפרוסה הופך אטום שוב במהירות.
מעקב אחר מקורות של RNase אקסוגני יכול להיות קשה, כי יש כל כך הרבה אפשרויות. ריאגנטים רק בשימוש אשר אינם במפורש RNase חינם הם O.C.T. ו תכלת B. אם התכלת B ביצעה באופן משביע רצון בעבר, נסה בקבוק טרי של O.C.T., אם כי מגיב זה מעולם לא היווה בעיה. ריאגנטים ללא RNase ניתן גם להחליף, אפילו מספק אחר. מקור הרבה יותר סביר הוא החוקר. בנוסף לניקוי יסודי של אזור העבודה, זה לעתים קרובות שימושי יש חבר מעבדה אחר בצע יחד ולבחון את כל השלבים בהליך. גם אם זה מישהו שאינו מבצע הליך זה באופן שגרתי, קבוצה חדשה של עיניים עשוי להרים מקור אחר מעיניהם של זיהום.
הרחבת פרוטוקול זה לשחזור RNA מתאי חוט שדרה אחרים, מתאי חוט השדרה ממינים אחרים, או מסוגי תאים ספציפיים באיברים אחרים תדרוש שינויים במספר תחומים המכוונים להשגת זיהוי ברור של תאי העניין תוך ניתוב, או לפחות צמצום, ההשפעה של RNase אנדוגני. בפרוטוקול כאן, הסרה מהירה והקפאה של חבל הטבור, יחד עם כתמי תכלת B ב 70% אתנול, אפשרו הן מזעור של השפלה RNA וזיהוי קל של גופי תא נוירון מוטורי. תכלת B הוא כתם היסטוכימי מבוסס היטב עבור נוירונים שנראה להיקשר RNA3 שימש להערכת תוכן RNA של נוירונים בדגימות נתיחה שלאחר המוות של רקמת המוח מחולים עם מחלה ניוונית6. יש לציין כי כתמי תכלת B לא השפיעו על שלמות ה- RNA המטוהר או על יכולתו להיות מתמללים ומנותחים לאחור. צבעים אחרים, כגון קריסיל סגול7 וכחול טולואידין8 שימשו בפרוטוקולי LMD דומים. איסוף גופי התא ישירות לתוך פתרון thiocyanate guanidine כפי שהם נותחו סיפק את הצעד האחרון שהביא להתאוששות השגרתית של RNA שלם.
גישות דומות ניתן לדמיין עבור תאים ואיברים אחרים, הכרה בכך זיהוי התאים של עניין תוך מזעור או, רצוי, מניעת השפלה RNA על ידי RNases אנדוגני היא הדרישה הקריטית לניתוח מוצלח. ברקמות שיש להן רמות גבוהות של RNase, כגון לבלב, טיפול מהיר וטמפרטורה נמוכה שולבו כדי לאפשר התאוששות של RNA מתאי β, תוך ניצול שפעתם האוטומטית הטבעית להדמיה9. נהלים באמצעות כתמי נוגדנים לזיהוי דווחו גם10, אבל לא הצליחו באופן מלא בידיים שלנו. לבסוף, מודלים רבים של עכבר זמינים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים(כלומר GFP, YFP, RFP) בתאים מעניינים, אשר יכול לשמש כדי לזהות אותם בחלקי רקמה על מיקרוסקופ LMD. למעשה, זנים העכבר ניתחנו עם פרוטוקול זה להביע חלבון היתוך בין SOD1 ו YFP11, ואת הנוירונים המוטוריים חוט השדרה שלהם הם פלואורסצנטיים מאוד. לא הצלחנו, עם זאת, למצוא קבוצה של שטיפות אתנול ו / או תנאי התייבשות כי בו זמנית להסיר את O.C.T., לעכב את פעילות RNase, באופן עקבי לשמור על פלואורסצנטיות YFP מספיק כדי לאפשר הדמיה של הנוירונים המוטוריים ואת ההתאוששות שלהם על ידי LMD. אולי חלבון פלואורסצנטי חדש או גרסה של אלה הזמינים השומרים על פלואורסצנטיות בממסים אורגניים ניתן למצוא כדי להתגבר על מגבלה זו.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לג’ורג’ פאר ולחברי מעבדת הורביץ על דיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |