Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.
İlgi çekici hücrelerden yüksek kaliteli RNA hazırlanması, hücre tipleri arasındaki transkripsiyon farklılıklarının veya sağlık ve hastalıkta aynı hücre tipi arasında veya farmakolojik tedavileri takiben kesin ve anlamlı bir analiz için kritik öneme sahiptir. Omurilikte, birçok nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkta ilgi çekici olan motor nöronlardan böyle bir hazırlık, motor nöronların toplam hücre popülasyonunun% <10'unu temsil etmesi nedeniyle karmaşıktır. Lazer yakalama mikrodisksiyonu (LMD) bu sorunu gidermek için geliştirilmiştir. Burada, endojen ve eksojen RNazların RNA hasarını önlemek için fare omuriliğini hızlı bir şekilde kurtarmak, dondurmak ve bölümlemek için bir protokol açıklıyoruz, ardından endojen RNaz'ı inhibe ederken motor nöronları tanımlamak için % 70 etanolde Azure B ile boyama. LMD daha sonra boyalı nöronları doğrudan guanidin tiyosiyanat lizis tamponuna yakalamak ve RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Toplam RNA'yı kurtarmak ve bütünlüğünü ölçmek için standart teknikler kullanılır. Bu malzeme daha sonra transkriptlerin RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış analizi için kullanılabilir.
Birden fazla farklı hücre tipinden oluşan memeli dokularında, lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LMD) enstrümantasyonunun ortaya çıkması, RNA veya protein düzeyinde analiz için belirli bir hücre tipi seçme imkanına sahiptir. Şu anda, amplifikasyon ve yeni nesil sıralama teknikleri, RNA’ların göreli seviyelerinin değerlendirilmesi ve çeşitli ekli formların tanımlanması da dahil olmak üzere transkriptomun nispeten kapsamlı bir envanterini elde etmek için birkaç bin hücreden toplam RNA havuzunun kullanılmasını sağlar. Bugüne kadar, birkaç bin hücrenin proteomik analizleri sadece daha bol türler aracılığıyla uzanacaktır. Örneğin, 3.000-4.000 motor nöron hücre gövdesinden (gösterilmeyen) en bol proteinlerin 1.000′< tespit ettik ve Zhu ve iş arkadaşları yakın zamanda ~15.000 tümör hücresinden 2.665 protein tanımladık1. Bununla birlikte, kütle spektrometresinin daha fazla gelişmesiyle, bu tür analizlerin çok daha derinliğe uzanması muhtemeldir.
Burada, farelerin omuriliklerinden motor nöron hücre cisimlerinin LMD’si için kullanılan özel bir protokol ve ardından RNA hazırlanması sunuyoruz. Bu protokol, presemptomatik transgenik mutant süperoksit dismutaz (SOD)1 amyotrofik lateral skleroz (ALS) farelerinin motor nöronlarından RNA’ları hem RNA-seq hem de qRT-PCR doğrulama2ile vahşi tip SOD1 transgenik suşundan hazırlanan RNA’larla karşılaştırma bağlamında kullanılmıştır. Özellikle, omurilikteki gri maddenin ön boynuzundaki motor nöronlar, astrosit denizi ile çevrili toplam hücre popülasyonunun% <10'unu oluşturur ve bu nedenle transkripsiyonal profilleri tüm kordonun çalışmalarından kolayca arındırılamaz. Lazer yakalama yaklaşımı, bu hücrelerdeki RNA ekspresyonunu analiz etmek için idealdir, fizyoloji kısa intra kardiyak salin perfüzyonunu takiben kordonu hızla çıkararak ve dondurarak korunur. Motor nöron somata büyüktür ve bu nedenle kolayca tespit edilebilir, burada nöronlar için güçlü bir benzeşime sahip bir boya kullanarak3. Ek olarak, bu boyutta, bu hücreler yakalanan hücre başına nispeten büyük miktarda RNA sağlar. Kullanılan prosedür, aşağıda ayrıntılı olarak açık olarak açıklanmış olduğu gibi, diğer nöronal hücre tiplerinin yanı sıra, özellikle boya boyama teknikleri veya antikor boyama ile tanımlanan diğer hücre tiplerini elde etmek için kolayca ayarlanabilir.
Omurilik dilimlerinin lazer mikroseksiyonu ile toplam RNA üretimi için bu protokolün en önemli başarı ölçüsü RIN değeri5 ‘tir. Daha yüksek ökaryotlardan alınan RNA örnekleri için, 8,5’in üzerindeki değerler düzenli olarak yüksek kaliteli sıralama ve qRT-PCR verileri verir. Verim düşük ancak kalite yüksekse, hazırlığı tekrarlayın. Bütünlük daha düşükse (hatta 7,5-8), ancak sorunun kaynağını bulmak ve yeniden denemek daha iyidir. Bir şeylerin ters gidebileceği birçok adım vardır, ancak gerçekten sorunun sadece iki kaynağı – endojen RNaz kontaminasyonu veya eksojen RNaz kontaminasyonu. Birincisi pratikle ele alınabilir, böylece farenin fedakârlıktan O.C.T gömülü kablosunu dondurmaya kadar geçen süre en aza indirilebilir. Protokolde endojen RNaze’nin zayıf bir sonuca katkıda bulunabileceği diğer nokta dilimlerin hazırlanması sırasındadır. Her dilim bir oda sıcaklığı PEN kaydırağını hızlı bir şekilde yapışmalıdır, ancak eriyecektir (O.C.T netleşir). Dilim ne kadar hızlı yeniden refrozen edilebilirse o kadar iyi. Kullandığımız kriyostat, odanın içinde -20 °C’de olan ve dilimi hızlı bir şekilde yeniden dondurmak için kullandığımız düz yüzeylere sahiptir. Kullanılan kriyostatta benzer bir nokta bulun ve dilimin tekrar hızlı bir şekilde opak hale geldiğinden emin olun.
Eksojen RNaz kaynaklarının izini sürmek zor olabilir, çünkü çok fazla olasılık vardır. Açıkça RNase içermeyen kullanılan tek reaktifler O.C.T. ve Azure B’dir. Azure B daha önce tatmin edici bir performans sergilediyse, bu reaktif hiçbir zaman sorun olmasa da, yeni bir O.C.T. şişesi deneyin. RNase içermeyen reaktifler, farklı bir tedarikçiden bile değiştirilebilir. Çok daha olası bir kaynak araştırmacı. Çalışma alanının kapsamlı bir şekilde temizlenmesine ek olarak, genellikle başka bir laboratuvar üyesinin prosedürdeki tüm adımları takip etmesi ve gözlemlemesi yararlıdır. Bu rutin olarak bu işlemi yapmayan biri olsa bile, yeni bir göz kümesi fark edilmeyen bir kirlenme kaynağı alabilir.
Bu protokolün RNA’yı diğer omurilik hücrelerinden, diğer türlerden omurilik hücrelerinden veya diğer organlardaki belirli hücre türlerinden kurtarmaya kadar uzatmak, endojen RNaz’ın etkisini ortadan alırken veya en azından en aza indirirken ilgi çekici hücrelerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için çeşitli alanlarda değişiklikler gerektirecektir. Buradaki protokolde, kablonun hızlı bir şekilde çıkarılması ve dondurulması, %70 etanolde Azure B boyama ile birleştiğinde, hem RNA bozulmasının en aza indirilmesine hem de motor nöron hücre gövdelerinin kolay tanımlanmasına izin verildi. Azure B, RNA3’e bağlanıyor gibi görünen nöronlar için iyi kurulmuş bir histokimyasal lekedir ve nörodejeneratif hastalığı olan hastalardan beyin dokusunun otopsi örneklerinde nöronların RNA içeriğini değerlendirmek için kullanılmıştır6. Özellikle, Azure B boyama, saflaştırılmış RNA’nın bütünlüğünü veya ters yazıp çözümlenme yeteneğini etkilemedi. Benzer LMD protokollerinde cresyl violet7 ve toluidine blue8 gibi diğer boyalar kullanılmıştır. Hücre cisimlerinin parçalanırken doğrudan guanidin tiyosiyanat çözeltisine toplanması, sağlam RNA’nın rutin olarak iyileşmesiyle sonuçlanan son adımı sağladı.
Diğer hücreler ve organlar için de benzer yaklaşımlar öngörülebilir, endojen RNa’lar tarafından RNA bozulmasını en aza indirirken veya tercihen önlerken ilgi çekici hücreleri tanımlamanın başarılı analiz için kritik gereklilik olduğunu kabul etmek. Pankreas gibi yüksek RNas seviyelerine sahip dokularda, hızlı kullanım ve düşük sıcaklık, görselleştirme için doğal otofluoresanslarından yararlanarak RNA’nın β hücrelerden geri kazanılmasına izin vermek için birleştirilmiştir9. Tanımlama için antikor lekeleme kullanan prosedürler de bildirilmiştir10, ancak elimizde tam olarak başarılı olmamıştır. Son olarak, LMD mikroskoptaki doku bölümlerinde tanımlamak için kullanılabilecek ilgi çekici hücrelerde floresan füzyon proteinlerini(örneğin GFP, YFP, RFP) ifade eden birçok fare modeli mevcuttur. Aslında, bu protokolle analiz ettiğimiz fare suşları SOD1 ve YFP11arasında bir füzyon proteinini ifade eder ve omurilik motor nöronları oldukça floresandır. Bununla birlikte, O.C.T.’yi aynı anda ortadan kaldıracak, RNaz aktivitesini engelleyecek ve motor nöronların görselleştirilmesine ve LMD tarafından iyileşmesine izin verecek kadar YFP floresanını sürekli olarak koruyacak bir dizi etanol yıkama ve / veya dehidrasyon durumu bulamadık. Belki de bu sınırlamayı aşmak için yeni bir floresan protein veya organik çözücülerde floresan koruyan mevcut proteinlerin bir varyantı bulunabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, George Farr’a ve Horwich laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklendi.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |