Total RNA af høj kvalitet er fremstillet af cellekroppe af mus rygmarvsmotor neuroner ved laserfangst microdissection efter farvning rygmarv sektioner med Azure B i 70% ethanol. Tilstrækkelig RNA (~ 40-60 ng) er genvundet fra 3.000-4.000 motoriske neuroner til at tillade downstream RNA-analyse af RNA-seq og qRT-PCR.
Forberedelse af højkvalitets RNA fra celler af interesse er afgørende for præcis og meningsfuld analyse af transskriptionelle forskelle mellem celletyper eller mellem den samme celletype i sundhed og sygdom eller efter farmakologiske behandlinger. I rygmarven kompliceres et sådant præparat fra motoriske neuroner, målet for interesse for mange neurologiske og neurodegenerative sygdomme, af det faktum, at motoriske neuroner udgør < 10% af den samlede cellepopulation. Laserfangstmikreksinfektion (LMD) er udviklet til at løse dette problem. Her beskriver vi en protokol til hurtigt at komme sig, fryse og sektionsmuse rygmarv for at undgå RNA-skader ved endogene og eksogene RNases, efterfulgt af farvning med Azure B i 70% ethanol for at identificere motorneuronerne, mens de holder endogene RNase hæmmet. LMD bruges derefter til at fange de farvede neuroner direkte ind i guanidin thiocyanat lysis buffer, opretholde RNA integritet. Standardteknikker bruges til at gendanne det samlede RNA og måle dets integritet. Dette materiale kan derefter bruges til downstream-analyse af udskrifterne af RNA-seq og qRT-PCR.
I pattedyr væv bestående af flere forskellige celletyper, fremkomsten af laser fange microdissection (LMD) instrumentering har givet mulighed for at vælge en bestemt celletype til analyse på RNA eller protein niveau. På nuværende tidspunkt gør forstærknings- og næste generations sekventeringsteknikker det muligt at anvende en pulje af det samlede RNA fra nogle få tusinde celler for at opnå en relativt grundig opgørelse over transskriptionen, herunder vurdering af relative niveauer af RNA’er og identifikation af forskellige splejsede former. Til dato vil proteomics analyser af et par tusinde celler nå ned gennem kun mere rigelige arter. For eksempel har vi identificeret < 1.000 af de mest rigelige proteiner fra 3.000-4.000 motoriske neuroncellelegemer (ikke vist), og Zhu og kolleger har for nylig rapporteret at identificere 2.665 proteiner fra ~ 15.000 tumorceller1. Med den videre udvikling af massespektrometri er det imidlertid sandsynligt, at sådanne analyser vil strække sig langt mere dybtgående.
Her præsenterer vi en specifik protokol, der bruges til LMD af motoriske neuroncellelegemer fra muss rygmarv efterfulgt af forberedelse af RNA. Denne protokol blev anvendt i forbindelse med sammenligning af RNA’er fra motoriske neuroner af presymptomatiske transgene mutante superoxid dismutase (SOD)1 amyotrofisk lateral sklerose (ALS) mus med RNA’er fremstillet af en transgen stamme af vildtypen SOD1 af både RNA-seq- og qRT-PCR-validering2. Især motor neuroner, i den forreste horn af det grå stof i rygmarven, omfatter < 10% af den samlede cellepopulation, omgivet af et hav af astrocytter, og som sådan, deres transskriptionelle profil kan ikke let dekonvoluteres fra undersøgelser af hele ledningen. En laseroptagelsesmetode er således ideel til analyse af RNA-ekspression i disse celler, hvor fysiologi bevares ved hurtigt at udskille og fryse ledningen efter kort intrakardi saltvandsperfusion. Motor neuron somata er store og er således let påviselige, her ved hjælp af et farvestof, der har stærk affinitet for neuroner3. Derudover giver disse celler med en sådan størrelse en relativt stor mængde RNA pr. indfanget celle. Den anvendte procedure, som beskrevet nedenfor, kunne let justeres for at opnå andre neuronale celletyper, samt potentielt andre celletyper, der specifikt identificeres enten ved farvepletfarvningsteknikker eller ved antistoffarvning.
Det vigtigste mål for denne protokols succes med at producere total RNA ved lasermikrobiation af rygmarvsskiver er RIN-værdien5. For RNA-prøver fra højere eukaryoter giver værdier over 8,5 regelmæssigt rækkefølge af høj kvalitet og qRT-PCR-data. Hvis udbyttet er lavt, men kvaliteten er høj, skal du gentage præparatet. Hvis integriteten er lavere (selv 7,5-8), er det dog bedre at finde kilden til problemet og prøve igen. Der er mange trin, hvor noget kan gå galt, men egentlig kun to kilder til problemet – endogen RNase forurening eller udefrakommende RNase forurening. Den første kan løses ved praksis, således at tiden fra ofring af musen til frysning sin O.C.T-indlejrede ledning er minimeret. Det andet punkt i protokollen, hvor endogene RNase kan bidrage til et dårligt resultat, er under forberedelsen af skiverne. Hver skive skal holde sig til en stuetemperatur PEN dias hurtigt, men det vil smelte (O.C.T bliver klar). Jo hurtigere skiven kan genfrosses, jo bedre. Den kryostat, vi bruger, har flade overflader inde i kammeret, der er ved -20 °C, som vi bruger til hurtigt at genfryse skiven. Find et lignende sted i den anvendte kryostat, og sørg for, at skiven hurtigt bliver uigennemsigtig igen.
Det kan være svært at opspore kilder til eksogen RNase, fordi der er så mange muligheder. De eneste reagenser, der ikke udtrykkeligt bruges RNase-fri, er O.C.T. og Azure B. Hvis Azure B tidligere har fungeret tilfredsstillende, kan du prøve en frisk flaske O.C.T., selvom dette reagens aldrig har været et problem. RNase-fri reagenser kan også udskiftes, selv fra en anden leverandør. En meget mere sandsynlig kilde er efterforskeren. Ud over en grundig oprydning af arbejdsområdet er det ofte nyttigt at have et andet laboratoriemedlem til at følge med og observere alle trinene i proceduren. Selv om dette er en person, der ikke rutinemæssigt udfører denne procedure, kan et nyt sæt øjne afhente en ellers ubemærket kilde til forurening.
En udvidelse af denne protokol til at genvinde RNA fra andre rygmarvsceller, fra rygmarvsceller fra andre arter eller fra specifikke celletyper i andre organer vil kræve ændringer på flere områder, der har til formål at opnå klar identifikation af de celler, der er af interesse, samtidig med at virkningen af endogene RNase undgås eller i det mindste minimeres. I protokollen her tillod hurtig fjernelse og frysning af ledningen kombineret med Azure B-farvning i 70% ethanol både minimering af RNA-nedbrydning og nem identifikation af motorneuronscellelegemer. Azure B er en veletableret histokemisk plet for neuroner, der ser ud til at binde sig til RNA3 og er blevet brugt til at evaluere RNA-indhold af neuroner i obduktionsprøver af hjernevæv fra patienter med neurodegenerativ sygdom6. Azure B-farvning påvirkede hverken integriteten af det rensede RNA eller dets evne til at blive omvendt transskriberet og analyseret. Andre farvestoffer, såsom cresyl violet7 og toluidinblå8, er blevet anvendt i lignende LMD-protokoller. Indsamling af celle organer direkte i guanidin thiocyanat løsning, da de blev dissekeret forudsat det sidste skridt, der resulterede i den rutinemæssige inddrivelse af intakt RNA.
Lignende tilgange kan forestilles for andre celler og organer, idet det erkendes, at identifikation af celler af interesse og samtidig minimere eller helst forhindre RNA nedbrydning af endogene RNases er det afgørende krav for en vellykket analyse. I væv, der har høje niveauer af RNase, såsom bugspytkirtel, hurtig håndtering og lav temperatur er blevet kombineret for at tillade inddrivelse af RNA fra β-celler, drage fordel af deres naturlige autofluorescens for visualisering9. Procedurer ved hjælp af antistof farvning til identifikation er også blevet rapporteret10, men har ikke været fuldt ud vellykket i vores hænder. Endelig er der mange musemodeller til rådighed, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner(dvs. GFP, YFP, RFP) i celler af interesse, som kan bruges til at identificere dem i vævsafsnit på LMD-mikroskopet. Faktisk udtrykker de musestammer, vi har analyseret med denne protokol, et fusionsprotein mellem SOD1 og YFP11, og deres rygmarvsmotorneuroner er meget fluorescerende. Vi var dog ikke i stand til at finde et sæt ethanolvask og / eller dehydreringsforhold, der samtidig ville fjerne O.C.T., hæmme RNase-aktivitet og konsekvent opretholde tilstrækkelig YFP-fluorescens til at tillade visualisering af motorneuronerne og deres genopretning af LMD. Måske kan et nyt fluorescerende protein eller en variant af de tilgængelige, der opretholder fluorescens i organiske opløsningsmidler, findes for at overvinde denne begrænsning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke George Farr og medlemmer af Horwich lab for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |