インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

持続性ウイルス感染の間に、ウイルス特異的T細胞は、T細胞の枯渇として知られるプロセスにおいて機能的欠陥を獲得する。初期の慢性ウイルス感染症のマウスLCMVモデルにおけるインビボ研究消耗ウイルス特異的T細胞は、ウイルス感染細胞に対する細胞溶解機能が低下して増殖する能力を失い、例えばIL-2、TNF-などのサイトカインを産生する能力が低下してきたことを示したαおよび^IFN-γ1,2。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路の複雑なネットワークは、慢性感染の間にアップレギュレートし^、（3,4に総説）T細胞の機能不全に寄与する。 インビボ LCMVマウスにおいてこれらの経路の阻害に対する阻止抗体の投与モデルは、T細胞の枯渇が^（5日）、部分的に可逆的な現象であることを示す、消耗したウイルス特異的T細胞の機能および拡張ウイルスクリアランスを回復した。

目の上の調査結果EのLCMVモデルは迅速なHBV、HCVおよびHIVの⁵のようなヒトの慢性ウイルス感染症にも拡張されました。慢性HIV-1感染では、PD-1およびIL-10経路は、感染患者でアップレギュレートされ、疾患進行のパラメータと相関、直接ウイルス量と反比例CD4と^6-8を数える。 LCMVマウスモデルに類似していることを示してPD-1またはHIV-特異的CD4およびCD8 T細胞のインビトロ復元増殖における IL-10経路の抗体遮断は、ヒトにおけるT細胞の枯渇は、部分的に可逆的な現象である。しかし、ヒトのサンプルだけでなく、in vitroアッセイの感度の限界の実験の繊細な性質のために、これらの介入によって達成機能回復プロファイルの徹底的な調査が著しく欠けている。増殖アッセイは、これまでのところ、ほとんどの研究でテスト唯一の信頼できるin vitroアッセイされているが、まだこれらの相互の影響に関する証拠の著しい欠如している上ventions：細胞傷害性T細胞の1）殺傷能力、2）ウイルス複製に対するT細胞の抗ウイルス効果、3）サイトカイン分泌プロファイル、および他の細胞サブセット上のCD4 T細胞ヘルプに4）の効果。

細胞内サイトカイン染色（ICS）は、マウスおよびヒトの両方における種々の細胞型においてサイトカインの産生を検出するために使用されるベースの非常に有用かつ広く使用されているフローサイトメトリーアッセイである。また、阻害性経路の遮断抗体の効果を調べるために使用されている。 ICSアッセイにおいて、サイトカイン分泌を、ブレフェルジンおよび/またはモネンシンを添加することによって遮断される。細胞内に捕捉されたサイトカインは、次いで、多色フローサイトメトリーを用いた蛍光抗体を用いて検出される。通常は、抗原添加の2時間以内に追加されブレフェルジンとモネンシン、どちらも細胞に対して毒性であるため、アッセイの期間は通常、抗原刺激後6か12時間に制限されています。 ICSアッセイは、便利なIされている強力な手法であるnは、細胞を抗体曝露後⁹時間の一定期間後に抽出されたマウスにおける抗体の介入を阻止するのインビボ投与の効果の調査。しかし、ヒト試料中の阻害性受容体の遮断の影響を評価するために、この実験的なアプローチを適用するためのいくつかの制限がある。 インビトロで 6または12時間刺激（ヒト試料と、典型的な場合）における阻害経路の抗体介入を行う場合は、標準的なICSアッセイにより測定されるように、ほとんどの場合、阻害性受容体の遮断が、抗原特異的T細胞応答の頻度を変化させない^6,7。平均値または中央値蛍光強度によって測定されるセル当たりのサイトカイン産生の測定値は矛盾した結果が^{図6、図7、図10を}与えている。一方、ICSは後後期の時点で実行されるときに、刺激（ すなわち、六日）、サイトカイン分泌数cの変化のエルを観察することができる。相違点は、変化した増殖、生存、および⁶時間の特定の期間にわたって蓄積するエフェクター機能の変化の複合効果である。部分的にこれらの制限を克服する1つの方法は、増殖が起こるのを待つことなく、サイトカイン分泌ブロッカーの添加前に抗原と、より長い期間（ 例えば 36時間、60時間など ）インキュベートすることである。我々は、正常にHIV特異的CD4およびCD8 T細胞^11,12によるサイトカイン分泌の動態を決定するために、このメソッドを使用しているが、このアプローチは、小さな応答を検出することができず、発生した総サイトカイン分泌の統合された結果を得られる刺激以来。したがって、ICSはsupernatanにおけるサイトカインmRNA定量またはサイトカイン分泌の測定値と比較して、活性化T細胞によって産生されるサイトカインの量に対する阻害経路の遮断の影響を検出するための敏感な十分な方法ではない同じ時点でT。さらに、活性化T細胞によって産生されるサイトカインのほとんどが正または負のフィードバックに貢献する自己分泌様式で作用し、抗原提示細胞との相互作用を介してループする。したがって、ICSアッセイの間またはモネンシン、ブレフェルジンの添加は、サイトカイン分泌を防止し、従って、T細胞の刺激が最適ではない。最後に、ICと複数のサイトカインの検出は、フローサイトメトリーと同様に、任意のパネルで同時に使用することができる蛍光色素の数の制約によって可用性とサイトカインの検出のための抗体の感度によって制限されます。

我々は、細胞（APC）及びナチュラルキラー細胞（NK細胞）が抗原提示するHIV特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を調節し、続いてCD4ヘルプの免疫調節経路の影響を評価するための高感度インビトロ実験的なアプローチを開発した。この方法はまた、IMPAを評価するために使用することができるPBMCからCD4 T細胞を枯渇させることによってのみ、CD8 T細胞によって認識され、最適なペプチドを用いて刺激することにより、CD8T細胞機能に対する阻害分子の遮断のCT。細胞内サイトカイン染色アッセイとは対照的に、我々のことができるようにするために、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を妨害しないことを決定した：1）産生されるサイトカインレベルのより正確な定量化を行うこと、2）広範なパネルを調べるサイトカインまたはエフェクター分子の、3）他の細胞サブセット上のHIV-特異的CD4 T細胞によって産生されるサイトカインの影響を評価する。私たちは、関心のある免疫調節経路のための抗体をブロックの存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで、CD8枯渇したPBMCを刺激する。インキュベーションの所望の時間の後、通常48時間後、我々は、ビーズアレイを有するサイトカイン分泌を測定し、異なる細胞サブセットの表現型分析または転写解析のためにいずれかの細胞ペレットを収集するために、上清を集める。注目すべきは、tにおけるその48時間の時点で、我々は、T細胞の増殖^し12の有意な集団を検出しない。これは、柔軟なアプローチであり、この設計のいくつかの適応は、異なる仮説に取り組むために適用することができる。 36時間さらにインキュベーションが上清および細胞ペレットの回収が続く前に、例えば、（例えば、HIV-特異的CD4 T細胞またはPD-1の高いCD4 T細胞などのような）個々の細胞サブセットを、インキュベーションの12時間後にソートすることができより具体的に定義されたPBMCのサブ集団によるサイトカイン分泌に対する遮断介入の影響を調査する。