In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

Tijdens aanhoudende virale infecties, virus-specifieke T-cellen te verwerven functionele stoornissen in een proces dat bekend staat als T-cel uitputting. Vroeg in vivo studies in muizen LCMV van chronische virale infectie aangegeven uitgeputte virus-specifieke T-cellen cytolytische functie verminderde tegen viraal geïnfecteerde cellen verliezen hun vermogen om te prolifereren en vermogen om cytokinen zoals IL-2, TNF-productie verminderde α en IFN-γ ^1,2. Een complex netwerk van immuunregulerende paden, zoals PD-1 en IL-10, opgereguleerd tijdens chronische infecties en bijdragen T-cel dysfunctie (besproken in ^3,4). In vivo toediening van blokkerende antilichamen tegen deze remmende trajecten in de LCMV muis model herstelde functie van uitgeputte virus-specifieke T-cellen en versterkte virale klaring, wat aangeeft dat T-cel uitputting is een gedeeltelijk reversibel fenomeen (beoordeeld in ^5).

Bevindingen op the LCMV model werd snel uitgebreid naar menselijke chronische virale infecties zoals HBV, HCV en HIV ^5. Bij chronische HIV-1 infectie zijn PD-1 en IL-10 trajecten opgereguleerd in geïnfecteerde personen en parameters correleren met ziekteprogressie, rechtstreeks bij de virale lading en omgekeerd met de CD4 telling ^6-8. Antilichaam blokkade van de PD-1 of IL-10 trajecten in vitro hersteld proliferatie van HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen aangeeft dat, vergelijkbaar met de LCMV muismodel T cel uitputting bij mensen is een gedeeltelijk reversibel fenomeen. Echter, vanwege de delicate aard van experimenten op de menselijke monsters, alsook beperkingen in de gevoeligheid van in vitro assays, grondig onderzoek van het functionele herstel profielen die door deze maatregelen is opvallend afwezig. Proliferatietesten zijn geweest, tot nu toe, de enige betrouwbare in vitro test getest in de meeste studies, maar er is een opmerkelijk gebrek aan bewijs over het effect van deze interinterventies op: 1) het doden capaciteit van cytotoxische T-cellen, 2) het antivirale effect van T-cellen virale replicatie, 3) de cytokine secretie profiel, en 4) het effect op CD4 T-cel hulp van andere cel subsets.

Intracellulaire cytokine kleuring (ICS) is een zeer nuttig en veel gebruikt flowcytometrie gebaseerde test die wordt gebruikt om de productie van cytokinen in verschillende celtypes in zowel muizen als mensen te detecteren. Het is ook gebruikt om het effect van antilichaam blokkade van remmende wegen onderzoeken. In ICS tests wordt cytokine secretie geblokkeerd door de toevoeging van Brefeldine en / of Monensin. Cytokinen opgesloten in de cellen worden vervolgens gedetecteerd met fluorescente antilichamen met polychromatische flowcytometrie. De duur van de test wordt meestal beperkt tot 6 of 12 uur na antigeenstimulatie aangezien zowel Brefeldine en monensine, die typisch worden toegevoegd binnen 2 uur antigeen Bovendien zijn giftig voor de cellen. De ICS-test is een krachtige techniek die nuttig i is geweestn het onderzoek van het effect van in vivo toediening van blokkerende interventie antilichaam in muizen wanneer cellen na een bepaalde tijd na blootstelling antilichaam ⁹ geëxtraheerd. Er zijn echter verscheidene beperkingen voor de toepassing van deze experimentele aanpak het effect van blokkade van remmende receptoren in humane monsters te evalueren. Bij het ​​uitvoeren antilichaam interventies remmende wegen in een 6 of 12 uur stimulatie in vitro (typisch het geval bij humane monsters), ofwel blokkade van remmende receptoren in de meeste gevallen niet de frequentie reageren antigeen-specifieke T-cellen te veranderen zoals gemeten met standaard ICS assays ^{6, 7.} Metingen van per-cel cytokineproductie gemeten door gemiddelde of mediane fluorescentie-intensiteit hebben inconsistente resultaten ^{6, 7, 10} gegeven. Anderzijds, wanneer ICS wordt uitgevoerd op een laat tijdstip na stimulatie (bijvoorbeeld zes dagen), veranderingen in het aantal cytokineafscheidende cel kan worden waargenomen. De verschillen zijn een gecombineerd effect van veranderde proliferatie, overleving, en veranderingen in effector functie die zich ophopen in de bepaalde periode ^6. Een manier om deze beperkingen te overwinnen gedeeltelijk is incuberen langere tijd (bijvoorbeeld 36 uur, 60 uur, enz..) Met het antigeen vóór de toevoeging van de cytokine secretie blocker zonder te wachten tot proliferatie te voorkomen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om de kinetiek van cytokine secretie bepalen door HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen ^11,12, maar deze aanpak is niet in staat om kleine responsen detecteren en zal een geïntegreerd resultaat van de totale cytokine secretie optreedt niet geven Sinds stimulatie. Daarom ICS is niet gevoelig genoeg methode om de impact van blokkade van remmende wegen van de hoeveelheid cytokinen geproduceerd door geactiveerde T-cellen ten opzichte van cytokine mRNA kwantificatie of metingen van cytokine secretie in de supernatan detecterent tegelijkertijd punten. Bovendien, de meeste van de door geactiveerde T-cellen cytokines handelen autocriene wijze bijdraagt ​​aan positieve of negatieve terugkoppelingen door interactie met antigen presenterende cellen. Daarom toevoeging van Brefeldine of monensine gedurende de ICS bepaling voorkomt cytokine secretie en derhalve stimulering van T-cellen niet optimaal. Tenslotte wordt detectie van meerdere cytokinen met ICS beperkt door de beschikbaarheid en gevoeligheid van antilichamen voor de detectie van cytokinen met flowcytometrie en door beperkingen in het aantal fluorochromen die kunnen worden gecombineerd in een bepaald paneel.

We hebben een zeer gevoelige in vitro experimentele aanpak het effect van immuunregulerende trajecten evalueren reguleren cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen en vervolgens CD4 hulp aan antigeen presenterende cellen (APC's) en natuurlijke killercellen (NK-cellen). Deze methode kan ook worden gebruikt om de impa evaluerenct van de blokkade van remmende moleculen op CD8 T-cel functie door het uitputten van de CD4 T-cellen uit PBMC of door het stimuleren van een optimale peptiden die worden alleen herkend door CD8 T-cellen. In tegenstelling tot intracellulaire cytokine kleuring assays, besloten we niet te bemoeien met de cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen om te kunnen: 1) voert een kwantificatie van de cytokine niveaus geproduceerd, 2) onderzoeken breder panel van cytokinen of effector moleculen, en 3) hoe de effecten van cytokinen geproduceerd door HIV-specifieke CD4 T-cellen op andere cel subsets. We stimuleren CD8 verarmde PBMC met een HIV-1 Gag peptideverzameling in aanwezigheid van blokkerende antilichamen voor de immuunregulerende route van belang. Nadat de gewenste tijd van incubatie, gewoonlijk 48 uur, verzamelen we de bovenstaande vloeistoffen te cytokineafscheiding meten met kraal arrays en het verzamelen van de cel pellets hetzij voor fenotypische analyse van de verschillende cel subsets of voor transcriptie analyse. Van de nota, bij tzijn 48 uur tijdstip, we niet een aanzienlijke populatie van delende T-cellen ¹² detecteren. Dit is een flexibele aanpak en verscheidene aanpassingen van dit ontwerp kan worden toegepast op verschillende hypothesen pakken. Zo kan de individuele cel subsets (HIV-specifieke CD4 T-cellen of PD-1 hoge CD4 T-cellen, enz..) Worden gesorteerd na 12 uur incubatie voor verdere incubatie gedurende 36 uur gevolgd door verzameling supernatanten en celpellets meer in het bijzonder onderzoeken de impact van de blokkade ingrepen op cytokine secretie door bepaalde subpopulaties van PBMCs.